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ISSN : 1976-7447(Print)
ISSN : 2287-7363(Online)
Journal of Biomedical Research Vol.13 No.1 pp.35-46
DOI : https://doi.org/10.12729/jbr.2012.13.1.35

Morphological and Histological Changes in Photoaged Hairless Mice Induced by Phellodendrin cortex Water Extract Application

Young-Chul Kim1*, In-Soon Bae1, Mi-Ja Shim2, Mi-Soon Park3
1Department of Public Health, Graduate School, Keimyung University, Daegu 704-701, Korea
2Department of Broadcasting & Entertainment Coordination, Gyeongbuk Provincial College, Yecheon Gun 757-807, Korea
3Department of Health Care, Graduate School, Hanseo University, Chungnam 356-706, Korea
(Received Jan 10, 2012, Revised Feb 18, 2012, Accepted Mar 8, 2012)

Abstract

This study was conducted in order to evaluate the alleviating effects of Phellodendrin cortex water extract (PCWE) on skin aging in hairless mice via observation of morphogical and histological changes. Skin aging was induced by UVB irradiation and application of squalene monohydroperoxide (Sq-OOH) to the back skin of hairless mice for six weeks. And, at the same time, saline (C), jojoba oil (VC), PCWE (E), and 0.01% retinoic acid diluted with polyethylene glycol (PC) were applied topically twice per day, six days per week, for a period of six weeks. Improved wrinkle formation in a pattern of shallow furrows and thin and narrow crests was observed in the retinoic acid and PCWE application groups, compared to the C group. On the morphologic analysis for skin wrinkles, the E group showed lower levels in skin roughness, maximum roughness, average roughness, smoothness depth, and arithmetic average roughness by 13.1, 17.2, 18.4, 15.4, and 16.1%, respectively, compared with the C group, indicating that PCWE inhibited potential formation of wrinkles in the skin. In the C group, structures of lipid lamellae and collagen fibers were broken or deformed with an irregular arrangement. Application of retinoic acid and PCWE protected against the deformity of lipid lamellae and collagen fibers. Elastic fibers in dermis of the C group also showed severe transformation; however, applications of retinoic acid and PCWE resulted in a significant decrease in the number of denatured elastic fibers. Therefore, PCWE could have an alleviating effect on skin aging induced by UVB irradiation and application of Sq-OOH.

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서 론

 과량의 자외선에 지속적으로 노출된 피부에서는 기질금속단백분해효소(matrix metalloproteinases, MMPs)의 과다한 발현증가로 세포와 세포외 기질의 변형이 관찰되며 피부 진피 조직의 교원섬유(collagen)와 탄력섬유(elastin)의 양과 탄성이 감소하고 피부세포 내 수분이 감소되어[1] 피부가 건조해지고 거칠며 탄력성이 저하되어 주름형성이 깊어진다[2]. MMPs는 세포외기질의 많은 성분을 분해할 수 있는 endopeptidase로서 염증세포에서만 만들어지고 자외선에 의한 광노화 피부에서는 피부표면 조직의 파괴로 표피가 두꺼워지고 진피에 피부염증을 유발, 비만세포의 탈과립, 홍반을 수반하게 된다[3].

 Squalene monohydroperoxide (Sq-OOH)는 과산화 된 squalene의 초기 생성물로 자외선에 노출됨으로써 피부에서 생성된다[4]. Hairless 마우스 실험에서 Sq-OOH는 활성산소종을 생성시키고 다른 monohydroperoxides나 자극제들 보다 더 피부거침, 각화층의 수분손실, 주름형성을 야기 시키는 것으로 보고되었다[5]. Hairless 마우스는 UVB 조사 시 표피세포의 과증식으로 인해 피부 두께가 두꺼워지고, 탄력섬유의 변형 등 표피와 진피의 변화 양상이 사람에게 일어나는 광노화와 유사한 변화가 나타나기 때문에 노화 연구 모델로 가장 널리 사용되고 있는 실험동물이다[6].

 Retinoid는 세포분화를 촉진하고 생체에 필요한 각종 단백질의 생합성 등의 기능으로 주름개선에 효과가 있는 것으로 보고되고 있다[7]. Retinol은 생체 내에서 레티노인산(retinoic acid)으로 변환되고, retinoic acid는 비타민 A 유도체로서 세포내 활성산소를 제거하여 세포의 증식을 억제하는 작용을 한다[8]. Retinoic acid는 transforming growth factor-beta (TGF-β)를 유도하고 TGF-β는 진피층에 있는 Type-1, 3의 procollagen 유전자의 생성을 유도하여 교원섬유의 합성을 증가시키며[7] 피지선 억제, 면역조절 및 항염증작용 등이 있어 여드름, 건선 등의 피부질환이나 피부암, T세포 림프종 등의 악성 종양의 치료에도 이용된다. 또한, 자외선 조사로 생성된 교원섬유 분해 효소인 MMP-1의 생성을 억제할 수 있기 때문에 광노화의 치료제로서 사용되기도 하며 retinol은 얼굴 등 피부의 주름을 예방 또는 개선하고자 하는 목적으로 기능성 화장품 원료로서 국내에서도 널리 상용되고 있다. 그러나 retinoid를 국소 도포제로 사용하는 많은 환자들은 레티노이드 피부염(retinoid dematitis)이라고 불리는 일종의 자극성 접촉피부염을 경험하게 되는데 증상은 홍반, 건조, 작열감, 소양감 등을 나타내며 환자들 중 다수가 이러한 부작용으로 치료를 중단하게 된다[9].

 최근 웰빙 열풍과 자연주의 확산으로 천연 소재를 이용한 기능성 화장품 개발이 지속적으로 증가하고, 천연물 소재개발이 전 세계적으로 매우 활발히 진행되고 있다. 황백(黃柏, Phellodendri cortex)은 운향과(rutaceae) 식물에 속하는 황벽나무(Phellodendron amurense Ruprecht)의 주피를 벗겨내고 말린 줄기껍질이다. 황백의 성분 중 berberine은 항산화 작용[10], 및 항염 작용[11]이 있는 것으로 알려져 있으나 현재까지 황백 열수추출물의 피부노화 억제효과에 관한 실험 문헌을 찾아보기 힘들어 그 유효성을 판단하기는 힘든 실정이다.

 이에 본 연구는 hairless 마우스에 반복적으로 UVB 조사와 Sq-OOH를 도포하여 피부노화를 유발시키면서 황백 열수추출물을 도포하여 피부 노화억제에 미치는 효과를 확인하였다.

재료 및 방법

시약 및 기기

 Hydrogen peroxide는 Junsei사(Japan)의 제품, hematoxylin, bovine serum albumin, retinoic acid, polyethylene glycol은 Sigma사(USA)의 제품, squalene은 Acros사(USA)의 제품, 호호바 오일(jojoba oil)은 Desert Whale사(USA)의 제품을 사용하였으며 그 외 일반시약들은 특급품을 사용하였다.

 실험기기 중 자외선 조사장치는 UVB sunlamp (UVM-225D, Mineral Lamp UVP, USA)를, 자외선 측정장치는 UV-radiometer (HD9021, Delta OHM, Italy)를 사용하였다. 피부유분 및 수분함량 측정은 각각 Sebumeter (SM815, CK electronic GmbH, Germany)와 Corneometer (CM825, CK ele-ctronic GmbH, Germany)를 사용하였다. 시료추출은 초고속 감압 저온 추출기(COSMOS-660, 경서기계산업, 한국)를 사용하였다. 조직표본관찰은 Olympus BX51 light microscope (Olympus, Japan)와 Progres C14 plus digital camera system (Olympus, Japan)을 사용하였다.

시료조제

 경북 영주시에서 유기농 재배한 황백 600 g을 구입하여 물 6 l를 가하여 초고속 감압 저온추출기로 열수추출한 후 5 l의 양을 얻었다. 5 l를 진공 농축 용기에 담아 2 l로 농축하였고 파우치 진공 포장 후 냉장 보관하여 실험에 사용하였다. 동결 건조로 측정한 황백 열수추출물의 수율(yield rate)은 15.27%였다. 황백 추출물 10 ml + jojoba oil 1 ml + 100% 에탄올 2.5 ml + 물 6.5 ml 비율로 혼합하여 황백 추출물 시료로 사용하였다.

실험동물 및 처치

 실험동물은 7주령의 SKH-1 hairless mouse (Charles-River, Japan)를 분양받아 1주일간 사육실에서 적응시킨 후 실험 전 기간 동안 사료와 물은 자유롭게 공급하였다. 사육실은 온도 22 ± 1℃, 상대습도 50 ± 5%, 조명주기 12시간씩 밤낮을 유지하였다.

 실험동물은 실험 6주째 되는 날 4시간 전부터 절식시킨 다음 에테르로 마취한 후 피부를 적출한 후 일부는 10% 중성 포르말린 용액에 고정하여 조직학적 검사에 사용하였고 나머지는 냉동보관 후 MMP 발현 측정에 사용하였다. 실험군은 정상군(Normal, N) : 아무런 처치를 하지 않은 군, 대조군(Control, C) : 자외선조사 + Squalene-OOH 도포 + Saline 도포군, 용매대조군(Vehicle Control, VC) : 자외선조사 + Squalene-OOH 도포 + 용매(100% 에탄올 + Jojoba oil + 물) 도포군, 양성대조군(Positive Control, PC) : 자외선조사 + Squalene-OOH 도포 + Retinoic acid 도포군, 실험군(Experimental, E) : 자외선조사 + Squalene-OOH 도포 + 황백 열수추출물 도포군, 총 5개 군으로 분류하여 군별로 5마리씩 총 25마리를 실험에 사용하였다.

피부노화 유발 및 시료도포

 자외선 조사장치의 광원은 302 nm의 UVB를 방출하는 sunlamp를 사용하였다. 마우스를 자외선 조사용 cage에 가둔 후 등 부위에 격일 간격으로 1주일에 3회, 6주 동안 조사하였으며, 자외선 조사량은 UV-radiometer로 측정하였다. 1주에는 100 mJ/cm², 2-3주는 200 mJ/cm², 4-6주는 300 mJ/cm²의 광량을 조사하였다. 피부염증을 유발하기 위하여 Sq-OOH를 1일 2회, 주 6일, 매회 100 μl씩 6주간 도포하였다. 황백 열수추출물(0.366 g/kg BW/day), 용매, saline은 1일 2회, 주 6일, 6주 동안 매회 200 μl씩 도포하였다. Retinoic acid는 polyethylene glycol에 0.01%로 희석하여 1일 2회, 주 6일, 6주 동안 매회 200 μl씩 도포하였다.

피부 유분함량, 수분함량 측정

 유분함량은 Sebumeter (SM815), 수분함량은 Corneometer (CM825)를 사용하여 비침습적 방법으로 실험기간 동안 주 1회 측정하였다.

피부조직의 형태·조직학적 관찰

1) 육안적 관찰

 피부의 육안적 관찰은 6주째 에테르로 가볍게 마취를 하고 디지털 카메라로 사진 촬영을 한 후 replica를 떠서 SV600 software program (C+ K, Germany)을 사용하여 주름지표를 분석하고 주름의 양상을 알아보았다.

2) Masson’s trichrome 염색 관찰

 절취한 피부조직을 실온에서 10% 중성 포르말린 용액에 24시간 고정한 후 통상적인 방법으로 수세, 탈수, 투명, 침투과정을 거친 다음 파라핀으로 포매하고 4 μm 두께로 절편을 만들어 실온에서 bouin 용액에 하룻밤 담그고 Masson’s trichrome 염색 후 진피층 내 교원섬유(collagen fiber)의 양과 형태를 광학현미경으로 관찰하였다

3) Verhoeff’s 염색 관찰

 절취한 피부조직을 실온에서 10% 중성 포르말린 용액에 24시간 고정한 후 통상적인 방법으로 수세, 탈수, 투명, 침투과정을 거친 다음 파라핀으로 포매하고 4 μm 두께로 절편을 만들어 Verhoeff 용액에 염색 후 수세, ferric chloride 2%로 감별 수세 후 sodium thiosulfate에 처리하여 피부 진피층 내의 탄력섬유(elastic fiber)의 변화, 소실 및 퇴행성 변화 등을 광학현미경으로 관찰하였다.

피부조직의 Matrix metalloproteinase-3

1) RNA 추출

 Deep freezer에 냉동보관 하였던 피부조직을 액화질소에 담아 이송한 후 얼음으로 저온을 유지시키며 조직 50 mg당 1 ml의 Trizol (Invitrogen, New Zealand)을 첨가하여 조직을 마쇄하고 실온에서 5분간 incubation 시킨 후 chloroform 200 μl를 첨가하여 실온에서 3분간 방치 후 15000 rpm, 4℃, 10분간 원심분리 하였다. 상층액을 취한 후 isopropyl alcohol을 500 μl 첨가한 다음 15000 rpm, 4℃, 15분간 원심분리 후 상층액은 제거하고 70% ethanol 1 ml을 첨가하여 RNA pellet을 washing하고 15000 rpm, 4℃, 2분간 원심분리하여 나온 상층액은 제거하고 남은 RNA pellet을 실온에서 건조 후 diethylpyrocarbonate (DEPC)로 희석하여 260 nm에서 optical density (OD)값을 측정하여 RNA를 정량하였다. 280 nm에서 OD값을 측정하고 absorbance ratio (A260/A280)가 1.8~2.0 사이인지 확인하였다.

2) cDNA 합성

 BioNEER사의 CycleScript RT PreMix (dT20) kit에서 제공하는 protocol에 따라 total RNA 양이 0.1~1 μg/μl가 되도록 RNA sample을 넣고 DEPC를 20 μl까지 채운 후 30℃에서 1분간, 50℃에서 4분간 12 cycle 반응시키고 95℃에서 5분간 가열하여 반응을 종결시켰다.

3) PCR과 전기영동

 BioNEER사의 AccuPower™ PCR PreMix kit를 구입하여 사용하였다. Template 2 μl, forward primer와 reverse primer (10 pmole/l, Bio- NEER, Korea)를 각각 1.4 μl, 멸균된 증류수 15.2 μl를 섞고 PCR 반응(Bio-RAD, Mycycler™ thermal cycler, USA)을 실시하였다. Primer는 대조군으로 GAPDH (57℃, 35 cycle), 실험군으로 MMP-3 (60℃, 35 cycle)을 사용하였으며 사용된 primer들의 염기서열은 Table 1과 같다. Tris-acetate ethylenediaminetetra acetic acid (TAE) buffer를 이용하여 1.5% agarose gel에 전기영동 시켜 ethidium bromide에 염색한 후 수세하고 UV를 조사하여 DNA band를 확인하였고 Gel Logic 100 Imaging System (Kodak, USA)을 이용하여 발현량을 수치화하여 통계처리 하였다.

Table.1. Nucleotide sequence of the primers and expected size of PCR products

자료 분석

 통계적 분석은 SPSS 12.0 for windows (SPSS Inc., USA)를 이용하여 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 이용하였고 각 그룹간의 차이를 검증하기 위하여 Duncan’s 다중비교분석을 이용하여 사후분석을 실시하였다. 통계적 유의성 검정은 α=0.05 이하에서 실시하였다.

결과 및 고찰

피부의 유분 및 수분함량

 피부 유분 및 수분함량의 변동을 측정한 결과는 각각 Table 2와 3과 같다. 실험 6주 후에 대조군, 용매대조군은 정상군에 비해 유의하게 낮았으며 대조군에 비교할 때 양성대조군은 약 25% 높았고 황백 열수추출물 도포군은 약 200% 유의하게 높았으며(P<0.05) 정상군과 비슷한 수치를 나타내었다. 피부 수분함량의 변동을 측정한 결과는 Table 3과 같다. 실험 6주 후에 대조군, 용매대조군은 정상군에 비해 유의하게 낮았으며(P<0.05) 양성대조군, 황백 열수추출물 도포군은 각각 약 18%, 22.5% 수분함량이 낮았다. 양성대조군과 황백 열수추출물 도포군은 대조군에 비해 각각 59%, 50.3% 유의하게 높았다(P<0.05). 이와 같이 황백 열수추출물 도포군은 대조군에 비해 피부 유분함량과 수분함량에 있어 유의하게 높게 나타나 표피층 내 피부장벽의 손상이 경감되었음을 확인하였다.

Table.2. Changes in lipid capacity of SKH-1 hairless mice skin in 6-week experiment to evaluate the inhibition effect of Phellodendri cortex water extract on skin aging

Table.3. Changes in water capacity of SKH-1 hairless mice skin in 6-week experiment to evaluate the inhibition effect of Phellodendri cortex water extract on skin aging

 피부는 외부 환경과 직접적으로 접하고 있는 광범위한 기관으로서 수분과 전해질의 손실을 막고, 세균의 침입을 막아주며 물리화학적 손상으로부터 인체를 보호하는 보호 장벽의 기능이 있다[12]. 자외선에 노출된 피부표면에서 지질과산화물의 함유량이 높으며 광노화 피부에서 만성적으로 태양에 노출된 부위에 지질과산화 생성이 증가된다. 각질층 지질은 피부장벽대의 역할인 각질층 내 수분유지와 함께 외부수분의 유입을 막는 기능을 담당하며 상피세포 증식조절, 세포 간 응집과 표피탈락에도 관여한다[13]. 피부장벽을 손상시키는 외부의 물리화학적 자극이 피부에 가해지면 표피를 통한 수분의 손실이 발생하는데, 이때에 칼슘이온 등의 표피내 농도를 변화시키고, 이는 피부장벽을 회복시키는 항상성 반응을 시작하는 신호로 작용하여, 각질세포간 지질의 전구체를 함유한 층판소체(lamellar body)를 분비시키고, 새로운 층판소체를 생성하여 손상된 각질세포간 지질을 보충하여 다시 튼튼한 각질세포간 지질막을 재형성하게 된다[14]. 이때 표피의 각질형성세포에서는 cytokine을 분비하여 각질형성세포의 증식을 직접 자극하거나 자극을 받은 진피내의 염증세포에서 분비된 cytokine에 의하여 각질형성세포의 DNA합성을 증가시키고 증식을 간접적으로 자극시켜서 표피의 증식을 초래한다[15].

피부조직의 형태·조직학적 변화

1) 육안적 및 주름지표 비교

 피부 주름의 형태를 비교한 결과는 Fig. 1과 같다. 정상군과 비교할 때 대조군은 주름 능선의 두께가 굵고 간격이 넓으며 주름이 깊게 형성된 반면, 양성대조군과 황백 열수추출물 도포군은 상대적으로 주름 능선의 두께가 얇고 간격이 좁으며 주름이 얕게 형성되어 있어 정상군에 가까운 양상을 보였다.

Fig. 1. Anti-wrinkle effect of 6-week Phellodendri cortex water extract application in photoaged SKH-1 hairless mice skin.

 피부주형을 이용하여 군별 주름 양상을 나타내는 객관적 지표(R1-R5)들의 분석치를 통계처리 한 결과는 Table 4와 같다. 피부 주름형태 분석에서 실험군이 대조군에 비해 R1 (Skin Roughness), R2 (Maximum Roughness), R3 (Average Rough ness), R4 (Smoothness Depth), R5 (Arithmetic Average Roughness)가 각각 13.1, 17.2, 18.4, 15.4, 16.1% 낮게 나타나 황백 열수추출물이 피부 노화의 대표적인 징후인 주름 형성 억제효과가 있음을 확인하였다.

Table.4. Comparison in wrinkle parameters of SKH-1 hairless mice skin induced by 6-week Phellodendri cortex water extract application

 인간의 피부에서 노화와 관련하여 관찰되는 변화 중 상피세포의 형태학적 변화와 더불어 각질층에서의 습윤 감소로 인한 거칠어짐과 주름 등이 두드러진다[16]. 피부는 자외선에 노출되면 표피의 각질형성세포와 진피의 섬유아세포의 표면에 있는 성장인자나 cytokine 수용체를 활성화시켜 nuclear transcription factor인 AP-1을 활성화시키고, 이는 matrix metalloproteinases (MMPs) 유전자 전사를 촉진시킨다. AP-1은 또한 섬유아세포에 작용하여 procollagen 유전자의 발현을 억제한다[17]. MMP는 진피의 교원섬유와 그 외 세포외기질 단백질을 분해시키는 작용을 하며 손상된 진피의 불완전한 수복은 세포외 기질을 기능적 구조적으로 취약하게 하여 반복적인 자외선 노출은 진피의 손상을 심화시키고 결국 광노화의 특징인 주름을 생성시킨다[18].

2) Masson’s Trichrome 염색 관찰

 진피층 내 교원섬유의 양과 형태를 관찰한 결과는 Fig. 2와 같다. 정상군은 교원섬유의 밀도가 조밀하고 배열이 규칙적인 반면, 대조군은 교원섬유가 파괴되어 밀도가 엉성하고 배열이 불규칙적이고 양도 많이 줄어있었다. 양성대조군과 황백 열수추출물 도포군은 대조군에 비해 교원섬유의 밀도가 조밀하고 배열이 규칙적으로 나타남을 확인하였다.

Fig. 2. Histological observation on collagen fibers in photoaged SKH-1 hairless mice skin after 6-week application of Phellodendri cortex water extract. Masson’s Trichrome stain, ×200.

3) Verhoeff’s 염색 관찰

 진피층 내 탄력섬유의 양과 형태를 관찰한 결과는 Fig. 3과 같다. 정상군은 탄력섬유의 배열이 규칙적인 반면, 대조군은 진피가 두꺼워지고 변성되고 엉긴 탄력섬유가 증가하였다. 양성대조군과 황백 열수추출물 도포군은 대조군에 비해 변성된 탄력섬유가 많이 줄어들어 있음을 확인하였다.

Fig. 3. Histological observation on elastic fibers in photoaged SKH-1 hairless mice skin after 6-week application of Phellodendri cortex water extract. Verhoff’s stain, ×200 & ×400.

 피부의 진피 조직 속에는 교원섬유와 탄력섬유가 그물망 구조를 형성하고 있는데, 이러한 탄력섬유는 elastase에 의해 분해되어 그물망 구조가 깨어지면서 피부가 처지고 주름이 생겨 내인성 피부노화가 발생한다. 선행연구에서 UV 조사에 의한 hairless 마우스의 진피층에서 교원섬유의 감소와 함께 변형된 탄력섬유가 다소 증가하는 탄력섬유증(elastosis)이 관찰되었으며[19], elastosis는 UV 조사에 의한 전형적인 병변으로 보고된바 있다[20].

피부조직의 MMP-3 발현 비교

 피부조직의 MMP-3 mRNA 발현량을 측정한 결과는 Fig. 4와 같다. 정상군에 비해 대조군은 유의하게 높았고(P<0.05), 용매대조군은 유의성은 없었지만 약 68.1% 높게 나타났다. 대조군에 비해 용매대조군, 양성대조군, 황백 열수추출물 도포군은 유의하게 낮았다(P<0.05). 이를 통해 황백 열수추출물이 자외선에 의한 MMP의 발현을 억제시키는 효과가 있음을 확인하였으며 이와 같은 결과는 대조군과 용매대조군에 비해 양성대조군과 황백 열수추출물 도포군이 교원섬유의 밀도가 조밀하고 배열이 규칙적이며 탄력섬유의 변성도 적게 나타난 조직학적 소견을 뒷받침해 준다.

Fig. 4. Comparison of MMP-3 mRNA expression in photoaged SKH-1 hairless mice skin induced by 6-week Phellodendri cortex water extract application.

 UVB 조사로 유도된 MMPs는 피부의 교원섬유를 감소시킨다. 그 중 MMP-3는 각질형성세포, 섬유아세포에서 발현되며[21], gelatin, proteoglycan, laminin, fibronectin, type III과 IV collagen을 포함한 다양한 세포외 기질단백질의 분해를 담당한다[22].

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