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ISSN : 1976-7447(Print)
ISSN : 2287-7363(Online)
Journal of Biomedical Research Vol.13 No.1 pp.13-20
DOI : https://doi.org/10.12729/jbr.2012.13.1.13

Hyaluronic Acid Promotes the Peripheral Nerve Regeneration in the Experimental Rabbit Model of Common Peroneal Nerve Crush Injury

Gonhyung Kim*, Hye-Ran Gong, Seok Hwa Choi
Laboratory of Veterinary Surgery, College of Veterinary Medicine, Chungbuk National University,52 Naesudong-ro, Heungdeok-gu, Cheongju 361-763, Korea
Received Jan 20, 2012, Revised Feb 9, 2012, Accepted Mar 8, 2012

Abstract

This study demonstrated that hyaluronic acid (HA) accelerated peripheral nerve regeneration after crush injury to the common peroneal nerve in an experimental rabbit model. Ten male New Zealand White rabbits, weighing 1.8 to 2.0 kg, were used in this study. After creating the nerve crush model in every right leg, rabbits were divided into two groups. Animals in group A received application of HA into the area surrounding the crushed nerve, and group B was the sham control. Electrophysiological assessment was performed every week. After 10 weeks, nerve histological examination, muscle weight and muscle histology were used to evaluate regeneration of the injured common peroneal nerve. No differences in electrophysiological assessment were observed between the two groups. In peripheral nerve histology, myelinated nerve fibers were observed more frequently and less connective tissue was observed in the crushed nerve of group A. Fewer muscle degenerative changes, such as fibrosis, atrophy, and centrally located myonuclei, were detected in group A than in group B. In conclusion, HA could become a potential neuroprotective agent for improvement of peripheral nerve regeneration after crush injury.

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서 론

 말초신경 손상은 수의임상에서 종종 발생되며 그 중 흔한 형태는 압박손상이다. 임상에서 특히 골절 발생시 생기는 혈종과 해부학적 변형에 의해 이러한 형태의 손상이 나타날 수 있다. 말초신경의 압박손상 후 축삭돌기와 수초의 재생은 매우 느린 과정으로 일어나며, 축삭돌기는 대략 하루에 1 mm 정도로 재생된다고 알려져 있다. 최근에는 압박손상에 의해 발생된 말초신경 손상의 재생을 촉진하기 위해서 수술적인 방법과 비수술적인 방법으로 물리적 치료, 약물의 도입 등 다양한 방법들이 연구 되고 있다[1].

 Hyaluronic acid (HA)는 N-acetylglucosamine과 D-glucuronic acid로 이루어진 고분자 glucosaminoglycan으로 연부조직과 활액 내에 존재하고 있다. 근래 들어 다양한 분야에서 HA에 대한 활발한 연구가 진행되고 있다. 어깨관절의 유착성 관절낭염 등에서 HA를 투여하면 활막액의 탄성 및 점도가 회복되어 관절의 보호, 윤활, 충격흡수나 장벽 효과 등의 작용을 하고 이에 따라 통증신경 섬유의 자극을 억제시켜 통증을 완화하고 관절운동기능을 향상시키며, 또한 안과 수술의 수술과정을 용이하게 하고 수술적 조작에 의한 조직의 기계적 손상을 방지하기 위해 사용된다. 국소마취제와 병용 투여하여 마취제의 작용시간이 연장되는 효과가 있으며, 주위 조직과의 유착의 정도 및 범위를 감소시키는 효과가 있어서 힘줄이나 복강 수술 후 나타나는 유착을 방지하기 위해 사용되고 있다. HA가 신경재생에 기여하는 기전에 대해서도 여러 연구를 통해 입증 되었다[2]. 림프구의 이동과 증식을 유도하며, 탐식세포의 이동을 제한함으로써 신경 바깥막과 신경 주위의 반흔의 생성을 억제하여 신경 재생을 증진한다. 신경주위조직의 반흔은 말초신경손상 후에 기능회복에 관여하는 중요한 요인 중 하나로 신경 바깥막의 반흔이 축삭 재생에 기계적인 장애를 주어 신경전달을 차단하며, 주위 조직과 신경을 유착시켜 신경축삭의 이동성을 제한하고 신경으로 가는 혈관을 수축시킨다. 그 결과 신경의 허혈 상태를 유발하여 불가역적인 손상을 유발한다. 또 HA의 효과는 세포 외 섬유소 기질의 재구성과 세포 기질 상호관계에 중요한 역할을 하여 세포 외 기질을 수화된 열린 격자의 상태로 구성하여 재생산되는 신경 축삭의 이동을 촉진시키는 것이다. 그리고 세포증식 자체에 영향을 주어 손상된 신경의 재생에 도움을 주기도 한다[3, 4].

 말초신경절단 모델에서 많은 연구가 진행되고 있으나, 임상에서 빈발하는 형태인 압박에 의한 말초신경 손상에 대한 연구는 드물기 때문에, 본 연구에서는 랫드의 말초신경 압박손상 모델에서의 HA 효능을 평가하였다.

재료 및 방법

 체중 1.8 - 2.0 kg의 New Zealand white 수컷 토끼 10마리를 HA적용군(Group A)과 sham 대조군(Group B)으로 각각 다섯 마리씩 나누고 오른쪽 다리에 말초신경압박 모델을 만들고, A군에 대해서는 HA약물 처치를 실시하였다. 왼쪽 다리는 아무 처치도 하지 않은 상태로 normal 대조군으로 이용하였다. 10마리의 토끼를 20 mg/kg tiletamine/zolazepam (Zoletil®, Virbac Lab., Carros, France)과 5 mg/kg xylazine (Rompun® , Bayer, Pittsburgh, PA, USA)으로 마취한 후 포비돈 알콜 소독 후에 오른쪽 무릎뼈의 피부를 뒷다리 장축 방향을 따라 4 cm 절개하였다. 대퇴두갈래근의 원위부 부착부위 일부를 절개하여 공통종아리신경을 노출시킨 후 신경이 장딴지근과 만나는 지점으로부터 근위부 10 mm 지점을 지혈겸자의 3 mm 넓이가 되는 부분으로 30초 간 압박하였다. 압박된 부위를 표시하기 위하여 8-0 nylon 봉합사를 이용하여 신경 압박부위로부터 근위 5 mm 지점 신경 바깥막에 봉합을 실시하였다. HA적용군인 다섯 마리의 Group A에는 HA를 0.3 ml씩(1 ml/10 mg : origin: cock’s comb) 국소 점적하였다. HA의 손실량이 적도록 하기 위해 근육의 둔성분리된 부위를 4-0 흡수성 봉합사로 봉합하였다. 4-0 흡수성 봉합사를 이용하여 절개한 대퇴두갈래근을 봉합한 후 피부는 4-0 비흡수성 봉합사를 이용하여 피내봉합으로 마무리 하였다 (Fig. 1). 수술 후 5일간 tramadol (5 mg/kg, sid)과 cefazolin (20 mg/kg, sid)을 투여하여 통증과 염증관리를 하였다.

Fig. 1. Crush injury model of rabbit common peroneal nerve. A. Exposed common peroneal nerve, B. Hemostat forceps used for crushing injury, C. After crushing injury, D. HA application into surrounding crushed nerve area.

 매주 1회씩 근전도계(KEYPOINT PORTABLE® , Alpine bioMed Co., Fountain Valley, CA, USA)를 이용하여 근전도를 평가하였다. 근전도 검사 시 probe를 피부에 대고 대퇴두갈래근과 반힘줄모양근을 압박하여 좌골신경에 8.0 mA 강도로 0.1 ms동안 전기 자극을 가하였다. 앞정간근의 근팽대 부위에 기록전극을 설치하여 latency와 amplitude를 측정하였다. 한 개체당 세 번의 값을 측정 기록하여 평균값을 구했으며, 각 개체의 평균값을 모아 군별로 평균값을 산출한 후에 대조군과 그 값을 비교하였다.

압박손상 모델을 만들고 10주 후, 동물을 희생시키고 양쪽 무릎의 안쪽부위부터 발목부위까지 피부절개를 하였다. 근위부로 5 mm 위에 봉합해둔 8-0 미세봉합사의 위치를 확인한 후에 봉합사의 근위부로 5 mm 위쪽과 압박부위의 원위부로 10 mm, 총 13 mm의 신경을 절단한 후에 10% formalin에 1주일간 고정한 후 trimming, embedding 한 후 3 μm두께로 section 하여, H&E 염색을 실시하였다. 평가는 신경의 유수화된 수초의 정도와 신경주위 결합조직의 양을 대조군과 비교 관찰하고 그 정도를 세 단계로 점수화 하였다. 신경의 유수화된 수초의 정도 평가는 다음과 같이 하였다. Grade 3은 대부분 축삭공간이 유수화된 수초로 가득찬 경우, Grade 2는 축삭공간이 유수화된 수초로 차 있으나 무수화된 수초가 여전히 발견되는 경우, Grade 1은 오직 무수화된 축삭만 발견되는 경우로 평가하였다. 신경주변의 결합조직 양의 평가는 Grade 3은 신경주위로 결합조직이 두껍게 형성된 경우, Grade 2는 신경주위로 결합조직층이 중간정도로 나타난 경우, Grade 1은 신경주위 결합조직층이 매우 얇게 형성된 경우로 평가하였다[5].

 근육의 평가는 조심스럽게 근막을 제거한 후 앞정간근을 절제하여 혈액과 같은 이물질을 생리식염수에 씻어내고 무게를 측정하여 대조군간의 차이를 비교하였다. 떼어낸 근육조직을 10% formalin에 1주일간 고정하고 4 μm 두께로 section하여 H&E 염색을 실시하였다. 근육조직의 형태와 핵의 위치 그리고 섬유화 정도를 비교하여 관찰하고 그 정도를 세 단계로 점수화하여 평가하였다. Grade 3은 다각형모양의 근섬유와 핵이 변연부에 위치하는 정상적인 형태를 보이는 경우, Grade 2는 근섬유의 변연이 무딘형태로 관찰되는 경우, Grade 1은 근섬유의 탈신경 위축과 증가된 섬유소들이 관찰되는 경우로 평가하였다.

 본 연구의 동물실험은 충북대학교 실험동물연구지원센터의 동물실험 윤리위원회의 승인하에 센터의 표준작업순서에 따라 수행되었다.

결 과

 압박손상 모델을 만들고 10주 후에 부검을 한 결과 대조군에서는 압박 손상된 주위에 주변조직과의 유착이 발견되었으며, 주위 연부조직으로부터 섬유조직의 침윤소견도 관찰되었다. HA 적용군에서는 정상과 거의 같은 연미색의 신경조직이 관찰되었으며 섬유조직의 침윤은 관찰되지 않았다.

 압박손상 모델을 만들기 전에 각 개체의 amplitude와 latency 값을 측정하였으며 압박손상 수술 후, 제대로 압박손상이 이루어졌는지 확인하기 위하여 다시 amplitude와 latency 값을 측정한 결과 latency 값은 수술 전 평균 1.51에서 수술 후 1.78로 거의 변화가 없고 amplitude 값은 평균 수술 전 17.8에서 수술 후 0.5를 나타내어 축삭불통이 일어난 압박모델이 만들어졌음을 확인하였다(Fig. 2).

Fig. 2. Electromyography waveforms. Preoperation (A) and postoperation (B) results in crushed injuries of common peroneal nerve.

 그 후 10주 동안 매주 같은 방법으로 amplitude 값을 측정한 결과 10주 후에, HA처리 군이 평균 10.3이고 대조군이 평균 7.9로서 HA적용 군이 높게 나타났으나 통계적으로 유의한 차이는 없었다.

 신경조직을 떼어내어 조직표본을 관찰하고 유수화된 축삭과 신경섬유주위 결합조직을 세 단계로 점수화하여 평가하였다(Table 1). 그 결과 압박손상만 가한 군의 경우는 1.40 ± 0.55이고, HA적용군의 경우는 2.13 ± 0.63으로 높게 나타났다. 정상신경조직표본의 경우는 2.90 ± 0.22로 유수화된 축삭의 관찰빈도가 평가됨으로 HA적용군에서의 유수화된 축삭이 대조군에 비해 정상 신경에 가깝게 회복되고 있음을 알 수 있었다(Fig. 3). 신경섬유주위 결합조직의 두께도 역시 세 단계로 점수화 하여 평가한 경우 압박손상만 처리한 군의 경우는 1.23 ± 0.32이고, HA적용군의 경우는 2.17 ± 0.58로 높게 나타났다. 이를 통해 HA적용군이 대조군에 비해 결합조직양이 줄었음을 알 수 있었다(Fig. 4). 근육조직 표본을 세 단계로 점수화하여 평가한 결과에서는 대조군이 1.33 ± 0.33이고, HA적용군이 2.23 ± 0.62으로 높게 나타났다(Table 1). 대조군의 근육표본에서는 크기가 작은 근섬유와 핵이 가운데에 위치한 근섬유들을 관찰할 수 있었으며, 섬유화된 결합조직이 증가된 것을 관찰할 수 있었다. 정상 근섬유들은 전형적인 다각형의 세포의 형태를 띄고 있었으며 핵이 변연부에 위치함을 관찰할 수 있었고 근섬유주변 결합조직이 관찰되지 않았다. 실험군인 HA적용군의 근육표본은 정상 근육표본과 거의 일치하는 조직학적 특성을 나타내고 있었다(Fig. 5).

Table.1. The histological findings of semiquantitative evaluation

Fig. 3. Representative images of myelinated nerve fiber (H&E stain, ×400). A: Axonal space was plugged by myelinated nerve fiber (Grade 3), B: Axonal space was plugged by myelinated nerve fiber and unmyelinated nerve fiber was still evident (Grade 2), C: A few myelinated nerve fiber (Grade 1).

Fig. 4. Representative images of connective tissue surrounding nerve fiber (H&E stain, ×100). A. Grade 3 showing thin layer of connective tissue surrounding nerve fiber, B. Grade 2 showang intermediate layer of connective tissue surrounding nerve fiber, C. Grade 1 showing dense layer of connective tissue surrounding nerve fiber. Scales: layers of connective tissue surrounding nerve fiber

Fig. 5. Representative images of degenerative muscle (H&E stain, ×100). A: Grade 3 showing normal muscle fiber with polygonal shape and eccentric myonuclei, B: Grade 2 showing concentric myonuclei and muscle fiber with blunted polygonal shape, C: Grade 1 showing atrophy of muscle fibers with increased fibrosis.

 근육무게는 안락사 후에 아무런 수술을 하지 않은 같은 개체의 반대편 다리무게에 대한 압박모델만 적용한 군과 HA를 적용한 군의 무게를 백분율로 나타내어 비교한 결과 sham 대조군의 경우 71.1 ± 15.9% 였으며, HA 적용군의 경우는 78.1 ± 14.7% 의 비율을 나타내었으나, 군간에 유의차가 없었다.

고 찰

 말초신경은 압박이나 물리적 손상 그리고 외상성 또는 의인성 신경절단 등에 의해 신경손상이 종종 발생된다[6, 7]. 중추신경과는 다르게 말초신경은 재생하는 능력이 있기 때문에 말초신경손상 회복을 위해 수많은 실험과 임상적 노력이 있었으나 아직까지 완전한 기능회복은 어려운 과제로 남아있다[8]. 현재까지의 말초신경 손상 치료를 위한 방법으로는 수술적 복구, 약물 치료 그리고 물리적 재활치료 등이 제시되었다[1]. 과거의 연구들은 말초신경재생을 위해 신경봉합의 기술적인 측면에서 미세수술기법 등에 초점이 맞추어진 외과적 방법들이 주로 연구되어져 왔으나 최근에는 손상 받은 신경의 생물학적 기전을 이해하고 이것을 바탕으로 신경재생을 증진하는 요소를 연구하는데 맞춰지고 있다[8]. 말초신경손상 중에 신경압박손상은 신경절단손상과는 다른 형태의 손상이 발생된다. 압박손상 후에 원위부의 축삭은 왈러 변성이 나타나며, 축삭 불통이 일어난다. 반면에 신경섬유를 둘러싸는 슈반세포의 기저막은 손상되지 않아 해부학적인 지속성은 유지되나 자발적 신경재생과 표적조직으로의 신경 재분포에는 좀 더 오랜 시간이 걸려 표적조직의 불용성 위축이 발생할 기회가 증가한다. 이와 같은 이유로 신경재생을 증진하는 연구의 중요성은 매우 크다[1]. 신경의 재생은 불용성 위축을 보이는 근육의 재건에도 중요하게 작용한다[9].

 HA는 절단된 신경에 적용하여 신경 재생촉진과 주위조직과의 반흔을 줄였다는 보고가 있다[10]. 이러한 효과가 말초신경 압박에도 효과가 있는지 알아보는 것이 이번 연구의 목적으로, 신경의 평가를 위해 10주동안 compound muscle action potential을 측정하였다. 그 결과 HA적용군과 대조군은 유의적인 차이를 보이지 않았다. 본 연구에서 사용한 측정방법은 피부절개를 하지 않고 피부에서 측정하는 법으로 신경에 직접자극을 주어 평가하는 방법과 다르게 10주라는 실험기간 동안 토끼의 무게변화로 인해 동일한 자극부위를 피부로부터 정확하게 찾는 것이 곤란하여 유의적인 차이를 보이지 않은 것으로 판단된다.

 10주 후에 신경을 육안적으로 관찰한 결과, HA군에서 신경주변조직의 섬유소 유착이 훨씬 적게 발생하였음을 확인하였고, 신경조직학적 검사와 근육조직학적 검사에서는 HA군의 말초신경재생이 증진된 결과를 보이고 있는데, 이러한 결과를 통해 말초신경 압박모델에서도 HA는 신경 재생을 촉진시킨다고 할 수 있다. 기존 절단 모델에서 HA가 반흔 형성을 억제하고 신경주위 조직과의 유착을 막음으로써 신경의 허혈 상태 유발로 인한 불가역적인 손상을 억제하는 기전이 밝혀진 바 있다[11]. 동일한 기전이 이번 연구 압박모델에서도 작용했을 것으로 추정된다.

 결론적으로 이번 실험 결과를 통해 HA가 단회 국소 적용만으로도 말초신경 재생 촉진에 도움을 준다는 사실을 알게 되었다. 이와 같은 결과를 바탕으로 말초신경손상이 발생할 우려가 있는 골절수복 수술이나 임플랜트 시술과 같은 경우에 말초신경주변으로 HA를 적용함으로써 수술 후 기능회복에 더 나은 결과를 가져오게 될 것으로 여겨지며 HA를 실제로 임상에 적용하는데 있어서 용량에 따른 HA의 효능의 차이를 평가하는 실험이 추가적으로 진행되어야 할 것으로 판단된다.

감사의 글

이 논문은 2010년도 충북대학교 학술연구지원사업의 연구비 지원에 의하여 연구되었음.

Reference

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