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ISSN : 1976-7447(Print)
ISSN : 2287-7363(Online)
Journal of Biomedical Research Vol.13 No.2 pp.119-132
DOI : https://doi.org/10.12729/jbr.2012.13.2.119

Effect of Iron-nanoparticles and Iron-microparticles on Erythropoiesis and Iron-storage in Iron-deficiency Anemic Mice

Jong-Soo Kim1*, Young Mi Kim1, Ki-ho Lee1, Dang-Young Kim1, Bong Su Kang1, Ja Seon Yoon1, Yoon-Bok Lee2, Jae-Hwang Jeong3, Sang Yoon Nam1, Young Won Yun1, Beom Jun Lee1*
1College of Veterinary Medicine and Research Institute of Veterinary Medicine, Chungbuk National University, Cheongju 361-763, Korea
2Central Research Institute, Dr. Chung’s Food Co. Ltd., Cheongju, 361-290, Korea
3Department of Biotechnology and Biomedicine, Chungbuk Province College, Okcheon 373-807, Korea
(Received May 18, 2012, Revised Jun 8, 2012, Accepted Jun 26, 2012)

Abstract

Iron is an essential trace element for normal functions of the body. Restriction of iron availability directly limits erythropoiesis. The objective of this experiment was to compare the bioavailability of iron nanoparticles (Fe-NPs) with iron-microparticles (Fe-MPs) in anemic mice. There were four experimental groups, including the normal control group, iron-deficiency anemia (IDA) group, Fe-NPs group, and Fe-MPs group. Animals in the normal group fed on an adequate iron-containing diet (45 ppm Fe). Meanwhile, animals in the other three groups fed on a low Fe diet (4.5 ppm Fe) for seven weeks. Double deionized water was supplied as drinking water ad libitum. After feeding for three weeks with the low Fe diet, animals in the Fe-NPs and Fe-MPs groups received oral administration of Fe-NPs or Fe-MPs at a daily dose of 40 mg/kg for four weeks. The IDA group showed markedly decreased red blood cell (RBC) count, hematocrit (Hct), and hemoglobin (Hb) values compared with the normal group throughout the experimental periods. Treatments with Fe-NPs or Fe-MPs for four weeks resulted in restoration of the decreased RBC count and hematological values similar to normal values. The Fe-NPs group showed faster restoration in values than Fe-MPs with passage of time. The iron contents of the upper small intestine in the Fe-NPs and Fe-MPs groups were higher than in the normal group at weeks 2 and 4. Treatment with Fe-NPs and Fe-MPs resulted in a significant increase in hepatic iron contents and lipid peroxidation, compared with the IDA group with passage of time. The iron contents in liver and ferritin deposits in spleen were identified in the Fe-NPs and Fe-MPs groups, similar to the normal group. These results indicate that oral administration of both Fe-NPs and Fe-MPs can result in recovery from anemia and Fe-NPs is more absorbable and available in the body than Fe-MPs.

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서 론

 철은 살아있는 거의 모든 생명체에서 반드시 필요한 미량 필수영양성분으로서 철의 부족 및 과잉은 동물체의 세포기능을 억제하거나 저하시키는 역할을 한다[1]. 일반적으로 체내 철 함유 물질은 대사와 효소 기능을 하는 기능성 철과, 운반과 저장에 사용되는 저장성 철로 크게 나뉜다. 철 결핍은 빈혈을 일으키는 주요한 원인으로서 전 세계 인구의 약 15%가 철 결핍성 빈혈(iron-deficiency anemia, IDA)을 가지고 있다[2]. 그리고 IDA의 경우 일반적으로 serum iron 수치는 낮고 total iron binding capacity (TIBC)는 높게 나타난다. 근본적으로 포유동물의 생체내에서 철의 항상성(homeostasis)은 철의 섭취, 저장, 손실의 세 가지 주요인에 의해 이루어진다[1, 3]. 우리 몸에는 hemoglobin (Hb), myoglobin (Mb), 그리고 여러 형태의 heme 단백질들이 체내 철의 약 85%를 차지하고 있으며, 남자의 경우 체중 kg 당 50 mg, 여자의 경우 체중 kg당 40 mg의 철을 체내에 가지고 있다[4]. 사람에게서 하루 순환되는 철의 량은 30-35 mg 정도이며, 이중 80%는 대식세포에 의해 파괴되어 골수에서 새로운 적혈구 생산에 이용되고, 그 나머지는 FsS cluster 및 nonheme 철을 함유하는 효소나 저장형의 ferritin 또는 hemosiderin의 형태로 존재한다[5]. 철 결핍증은 체내 저장성 철이 고갈된 후 철 공급이 부족하여 기능성 철의 요구량을 충족시키지 못할 때 흔히 발생한다. 그러나 세포 수준에서는 만성질병에서 나타나는 빈혈과 같이 섭취량과 저장량은 충분한데도 불구하고 철이 잘 유출되지 못하여 철 결핍이 생기는 경우도 있다[2, 6]. 철 과잉 섭취 시에는 철 저장량이 불균형적으로 커져서 심한 경우, 기능성 철의 10배 이상이 될 수도 있다[1].

 철의 흡수는 식사 내 철의 함량, 식사 내 철의 생체이용성(bioavailability), 철 저장량 그리고 적혈구 생성률 등에 따라 영향을 받는다[3, 7]. 식사로 섭취되는 nonheme 철과 heme 철은 각기 다른 기전에 의해 흡수된다[8]. 대부분 철염(iron salt)으로 구성되어 있는 nonheme 철은 주로 식물성 식품과 유제품, 철 강화식품 등에 존재하며 섭취하는 총 철의 약 85%이상을 차지한다. 철은 Fe(II)의 형태로 소장 융모 상피세포의 미세융모에서 흡수되며, 특히 소장 중에서도 십이지장과 상부 공장에서 주로 흡수된다[7, 8]. 철은 Fe(II)의 형태로 흡수되지만 음식 등으로 섭취하는 철은 주로 Fe(III)의 형태이다. 따라서 nonheme 철의 흡수는 소장 상부에서의 철의 용해성에 많은 영향을 받으며, 이는 결국 식사 전체의 조성이 철의 용해성에 어떻게 영향을 주느냐에 달려 있다[9]. 보통 nonheme 철의 흡수는 같은 끼의 식사로 섭취한 증진인자나 방해인자들에 의해 영향을 받는다[10]. 또한 다른 모든 조건이 동일하다면 식품중의 nonheme 철 양이 많을수록 흡수율은 낮아진다. 위산 및 vitamin C는 Fe(III)을 Fe(II)로 환원시키며, 용해도를 증가시켜 흡수를 돕는다[9, 11]. 흡수된 Fe(II)는 장점막에서 Fe(III)의 형태로 바뀌어 혈액으로 들어간 후 transferrin에 결합하여 이동한다. Transferrin은 세포막의 수용체를 통해 transferrin-iron complex를 결합시켜 세포 내로 운반하고 세포 내에서 철은 복합체로부터 유리된다[1, 12]. 총 체내 철의 1% 미만만이 운반 상태, 즉 장점막이나 세망내피세포(reticuloendothelial cells)로부터 적혈구를 생산하는 골수와 같이 철을 많이 요구하는 조직으로 운반된다[13]. 몸에 저장된 철 중 약 25%가 ferritin과 hemosiderin의 형태로 세망내피계인 간과 비장, 골수에 저장되며 70%의 철은 Hb에 저장된다[13]. 철 저장량은 철 결핍성 빈혈이 나타나기 전 거의 고갈되며, 또한 정상 철 저장량의 20배 이상이 된 후에야 과잉 축적으로 인한 조직 손상이 일어난다. 철 저장량이 낮거나 결핍인 경우 또 빈혈이 있는 경우, 저장량이 많고 빈혈이 없는 사람보다 훨씬 많은 양의 nonheme 철을 흡수한다. 심한 철 결핍으로 빈혈인 사람의 nonheme 철의 흡수율은 50%까지 높아질 수 있다[9]. 남성의 총 철 배설량은 평균 하루 평균 1.0 mg(0.5-2.0 mg/day) 정도이며, 주로 담즙, 탈락된 장 점막세포, 소량의 혈액 등이 변으로 배설될 때 소실되며, 탈락되는 피부 세포와 땀, 오줌을 통해서는 아주 적은 양의 철이 손실된다[14].

 현재 철 나노입자(iron-nanoparticles, Fe-NPs)는 반응 표면에서 높은 밀도를 보이거나 높은 내재적 반응성을 보임으로써 생물의학분야에서 실험실적 진단이나 암 치료 등에 여러 방면으로 적용되고 있다[15, 16, 17]. 이러한 대부분의 이용은 정맥 내 주입을 통해 이루어지며, 정맥내 주입은 약물이 완전히 흡수되어 그 효과가 빠르고, 조직이나 위장관에서 흡수가 잘 안 되는 약물이나 흡수 전에 파괴되는 약물을 투여할 수 있는 장점이 있지만, 환자의 순환이 좋지 않은 경우에는 약물의 분산이 억제되고 급속한 부작용의 발생, 투여하는 혈관, 신경 및 조직의 손상 등의 단점이 있다. 동물 실험에서 나노 입자를 정맥 투여 했을 때 나노 입자는 세포와 조직에 파고들어 생화학적 데미지를 주는 것이 밝혀졌다[18]. 현재 나노 철의 경우 자성을 이용하여 많은 질병의 진단 및 치료에 적용되고 있지만, 나노 철의 영양학적 가치에 대해서는 아직 연구되지 않고 있다. IDA를 치료하기 위해 많은 철 함유 상품이 판매되고 있지만, 입자가 작은 나노 철 투여가 흡수 및 체내이용에 어떻게 영향을 미치는지는 밝혀지지 않았다[19].

 본 연구에서는 철분 결핍사료로 유도된 빈혈 마우스에서 마이크로 크기의 철과 나노 크기의 철을 경구투여한 후 흡수 및 체내 이용을 비교함으로써 영양학적 가치를 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

시험 물질

 Fe[Fe(II, III)oxide]와 Fe-NPs는 Sigma-Aldrich사(St. Louis, USA)로부터 구입하였다. Ascorbic acid는 Amresco사(Ohio, USA)로부터 구입하였다. Fe-NPs의 particle size는 50 nm이하, 표면적 크기는 60 m²/g 이상으로서, 98% 이상의 이 미량금속을 포함한 Iron(II,III) oxide nanopowder를 사용하였다. AIN-93G purified rodent diet는 Dyets사에서 구입하였다(Bethlehem, USA). Perl`s stain에 쓰이는 10% potassium ferro-cyanide, nuclear fast red 및 20% hydrochloric acid는 Sigma-Aldrich사(St Louis, USA)로부터 구입하였다.

실험 동물

 실험동물은 male C57BL/6 120마리를 (주)오리엔트바이오(경기도 성남, 한국) 에서 구입하여 폴리카보네이트 케이지당 4마리씩 넣어 사육하였다. 사육환경은 실내온도와 습도가 20 ± 2℃와 50 ± 20%가 되게 유지하였다. 또한 명암은 12시간을 주기로 하였고 1주일간 순화시킨 후 군분리를 하여 실험을 진행하였다. 동물실험은 충북대학교 동물실험 윤리위원회의 승인(CBNUA-217-1003-01)을 받아 윤리적으로 실시되었으며 실험기간 동안 체중, 음수사료 소비량은 매주 측정하였다.

실험동물사료

 사료는 20% casein, 39.7% cornstarch, 13.2% dyetrose, 10% sucrose, 5% cellulose, 7% soybean oil, 0.0014% t-butylhydroquinone, 1% vitamin mix, 0.3% L-cystine, 0.25% choline bitartrate, 3.5% salt mix로 정제된 AIN-93G 설치류 사료를 사용하였다. 철 결핍 사료는 salt mix를 제외한 다른 성분은 정상 사료와 동일하다. 철 결핍 사료의 salt mix는 철이 함유되지 않았다. 철 결핍 사료에는 4.5 ppm의 철이 그리고 정상 사료에는 45 ppm의 철이 함유되었다(Table 1).

Table.1. Composition of experimental diets

실험 설계

 3주령 된 male C57BL/6를 1주일간 사육환경에 순화시킨 후, 정상군 40마리와 철분결핍사료에 의한 IDA군 80마리로 군을 분리하였다(Fig. 1). 정상대조군은 정상 농도의 철분을 포함한 사료(Fe 45 mg/kg)를 7주간 급여하였고, IDA 유발군은 철분 결핍사료(Fe 4.5 mg/kg)를 7주 동안 자유 급이 하였다(Fig. 1). 철분 결핍사료를 투여 후에 red blood cell (RBC), hemoglobin (Hb), hematocrit (Hct)가 정상군에 비해 유의적인 차이가 발견된 3주 후에 IDA군, Fe-NPs 및 Fe-MPs의 3군으로 분리 하였다. Fe-NPs 투여군, Fe-MPs 투여군은 철분 결핍사료(Fe 4.5 mg/kg)를 4주 동안 자유 급이 하였다(Fig. 1). 처음 3주간은 정상대조군 및 IDA군에서 매주 5마리씩 부검하여 복대동맥을 통해 채혈하여 빈혈의 유발정도를 측정했다. 3주의 빈혈유발기간이 끝난 후, IDA 유발군은 saline, Fe-NPs 투여군은 Fe-NPs (40 mg/kg b.w), Fe-MPs 투여군은 Fe(II, III) oxide (40 mg/kg b.w)를 매일 동일한 시간에 경구 투여하였다. 이때 시험물질 Fe-NPs와 Fe-MPs는 saline으로 현탁액을 만들어 0.3 ml을 경구로 투여하였다. 투여 시작 0, 1, 2, 3, 4주째 되는 날 부검하였다. 부검 후 복대동맥채혈을 통해 RBC, Hb, Hct를 측정하였고, 간, 소장의 장기에서 inductively coupled plasma spectrophotometer (ICP-AES)로 철분 함량을 분석하였으며 간에서는 Prussian blue stain (Perls’ stain), 비장에서는 ferritin 면역화학염색을 실시했다.

Fig. 1. Experimental design for bioavailability of Fe-NPs and Fe-MPs in mice. IDA: iron-deficiency anemia, Fe-NPs: iron-nanoparticles, Fe-MPs: iron-microparticles. For the first 3 weeks, mice in N and IDA groups were assigned to experimental necropsy.

RBC, Hb 및 Hct 측정

 매주 부검 후에 복대동맥으로 부터 채혈한 혈액은 EDTA 항응고제가 들어 있는 진공채혈관(EDTA microvette tubes)에 넣어 rotary agitator상에 교반하여 채혈 후 2시간 이내에 분석하였다. 자동혈액분석기인 ADVIA®  2120 Hematology System (Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL, USA)에 혈액 200 μl을 주입하여 RBC, Hb, Hct를 측정하였다. 이 자동혈액분석기에서 혈색소(Hb)의 측정은 cyanmethemoglobin (HiCN)방법을 원리로 적용하였다.

Total iron-binding capacity (TIBC) 측정

 부검 당일, Ether 마취를 하여 복강을 절개한 후 복대정맥에서 채혈을 하여 혈청분리관에 담았다. 그 후 3,000 rpm에서 15분 동안 원심 분리하여 혈청을 분리하고, 이 혈청에 FeCl3를 첨가하여 transferrin을 포화시킨 후, 과도한 Fe+3을 MgCO3로 흡착시켜 원심 분리하여 상부 층을 얻고 상층부의 철의 농도를 측정하였다.

철분 촉매 지방과산화 측정

 간조직의 homogenate를 만들어 지방과산화반응을 thiobarbituric acid-reactive substance (TBARS) assay kit (Cayman, MI, USA)를 사용하여 제조회사의 사용방법에 따라 malodialdehyde (MDA)량을 측정하였다. MDA-TBA adduct가 산성의 높은 온도(95℃)에서 MDA와 TBA가 반응하여 핑크색을 나타내고, 이 핑크 MDA-TBA adduct를 spectrophotometer로 532 nm에서 absorbance를 측정하였다. 결과는 TBARS μM/mg protein으로서 나타내었다.

Prussian blue iron stain (Perls' stain) 검사

 장기 내에 저장되어 있는 ferric iron을 측정하기 위한 방법으로, 부검 후 간을 10% 중성 완충 포르말린에 고정한 후, 파라핀으로 포매하였다. 이것을 microtome으로 5 μm의 두께로 절편을 만들어 코팅슬라이드에 표본을 만들었다. 염색하기 전 65℃ 오븐에서 1시간 동안 파라핀을 녹인 후 xylene, 100, 95, 80, 70% ethanol순으로 탈 파라핀 한 다음 deionized water (DW)에서 수세하였다. 그 후 10% potassium ferrocyanide와 20% hydrochloric acid를 1:1로 섞은 working 용액으로 20분간 60℃에서 중탕한 후 다시 DW로 수세하였다. 이후 Nuclear fast red로 4분간 염색하고 잔유물이 남지 않게 수돗물로 15분 동안 수세하였다. 이 후 70, 80, 95, 100% ethanol순으로 재빨리 탈수 한 후 xylene에서 3분 동안 청명화한 후 봉입하였다. 염색된 조직은 광학현미경(Olympus, Tokyo, Japan)를 통해 ×100배에서 관찰하였다.

철분 농도 측정

 ICP-AES는 장기 내의 철 함량 분포를 측정하기 위한 방법으로 시료중의 금속원소에 에너지를 가하여 원소가 안정화되면서 방출하는 스펙트럼을 분석하는 것이다. 부검 후 액체 질소에 보관해 놓은 간, 소장 상부를 0.25 g씩 10% HNO3에 재워둔 바이엘에 넣은 후, 60% HNO3 1.0 ml를 넣고 hot plate에서 가열하였다. 반응이 더 일어나지 않을 때 까지 가열한 후, 30-35% H2O2 100 μl를 첨가하였다. 지속적으로 HNO3 0.5 ml과 H2O2 50 μl를 차례로 넣어서 위의 과정을 4번 더 반복하여 반응액의 색이 노란색-투명색이 될 때 까지 반복하였다. 3차 DW 1 ml를 넣어 남아있는 산을 날린 후 다시 DW를 1.0 ml넣어 기화시켰다. 거의 재만 남은 상태에서 밀봉하여 보관하였다가 측정 직전에 DW 10 ml를 넣어 OPTIMA 7300DV (Perkin Elmer, Massachusetts, USA)을 이용하여 측정했다.

면역조직화학검사

 비장 조직 슬라이드를 탈 파라핀과 함수, PBS세척 후, 과산화수소수를 100% methanol에 3% 농도로 희석하여 30분 반응 시키는 peroxidase quenching을 시킨 후, PBS로 세척하고 비특이 반응을 막아주는 blocking serum을 붙인 후 일차항체, 이차항체를 차례로 붙이고 ABC반응과 DAB발색 과정 후 대조염색을 하여 100배율 광학 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰 촬영하였다.

통계분석

 실험결과의 data는 평균(mean) ± 표준편차(SD)로 표시하였다. 실험 data는 SAS version 9.1.2 software (SAS Institute, Cary, NC, USA)를 사용하여 ANOVA 분석을 하였고, Student’s t test 혹은 Dunn’s multiple range test를 이용하여 그룹간의 유의적 차이를 P<0.05 혹은 P<0.01의 수준에서 비교하였다.

결 과

빈혈유도기간 내 체중 및 체내 철분지표의 변화

 빈혈유도를 위한 실험 3주 동안 주 1회 체중을 측정하였고, 정상 사료를 급여한 군에 비해 철분결핍사료를 급여한 군에서 체중 증가율이 완만하였다. 실험 3주간에 체중에서는 정상군과 IDA군간에 유의적 차이는 관찰되지 않았다(Table 2).

Table.2. Change in body weight and iron-biomarkers in mice fed normal or iron-deficient diet for 3 weeks

 Table 2에서와 같이 RBC, Hb 및 Hct는 실험 1주 동안은 정상군과 IDA군에서 유의적 차이를 보이지 않았으나, 실험 3주째는 정상군에 비해 IDA군에서 유의적으로 낮게 나타났다(P<0.01).

체중변화

 빈혈유발 3주를 실험 기점 0 week로 하여 4주간 매주 체중을 측정하였다. 실험 0-2주까지는 체중에 유의적 변화가 관찰되지 않았으나, 실험 3주째에 IDA군에 비해 Fe-NPs 군이 유의적으로 높았으며, 실험 4주째는 Fe-NPs 및 Fe-MPs군 모두 IDA군에 비해 유의적으로 높은 체중증가를 보였다. 그러나 정상군과 Fe-NPs 및 Fe-MPs군 사이에서는 유의적 체중변화가 관찰되지 않았다(Fig. 2).

Fig. 2. Changes in body weights of mice for 4 weeks. IDA: Iron-deficient anemia, Fe-NPs: Iron-nanoparticles, Fe-MPs: Iron-microparticles. Data points represent mean ± SD (n=5). †Fe-NPs group are significantly different from IDA group at P<0.05. *Fe-MPs group is significantly different from IDA group at P<0.05.

주요장기 무게의 변화

 Table 3에서 보는 바와 같이 4주의 시험기간 동안 간의 중량은 2주 및 4주째에 정상군에 비해 IDA군에서 유의적 감소가 관찰되었으며, 반대로 비장에서는 정상군에 비해 IDA군에서 유의적 증가가 관찰되었다(P<0.05). 그러나 Fe-NPs 및 Fe-MPs군은 정상군 및 IDA군에 비해 모두 유의적 차이가 관찰되지 않았다(Table 3). 폐와 왼쪽 신장의 무게는 모든 시험군간에 유의적 차이가 관찰되지 않았다(Table 3).

Table.3. Absolute major organ weights in mice for 4 weeks

RBC의 변화

 IDA 그룹에서 RBC 수치는 철분결핍사료 공급에 따라 지속적으로 낮아졌으며, Fe-NPs 및 Fe-MPs 투여는 이러한 RBC 수치를 개선시켰다(Fig. 3). Fe-NPs 투여군은 IDA군에 비해 투여 1주 후부터 유의적으로 RBC 수치를 증가시켰으며, Fe-MPs군도 투여 2주부터 유의적으로 RBC 수치를 증가시켰다(P<0.05). 특히, 투여 후 2주부터는 정상군과 유의적 차이가 관찰되지 않았다. 나노 혹은 비나노 철분 투여 4주 후에는 RBC 수치가 정상수치에 도달하였다(Fig. 3).

Fig. 3. Changes in red blood cell counts for 4 weeks in mice.IDA: Iron-deficient anemia, †Fe-NPs: Iron-nanoparticles, Fe-MPs: Iron-microparticles. Data points represent mean ± SD (n=5). †Fe-NPs group is significantly different from IDA group at P<0.05. *Fe-MPs group is significantly different from IDA group at P<0.05.

Hemoglobin 농도의 변화

 Hb 농도는 철분결핍사료의 공급으로 IDA군에서 지속적으로 시간의 경과에 따라 낮아졌다(Fig. 4). Fe-NPs 및 Fe-MPs 투여군은 투여 1주후부터 IDA군보다 유의적으로 높은 농도를 나타냈다(P<0.05). Fe-NPs군이 Fe-MPs군보다 빠른 속도로 Hb를 정상 수준으로 회귀시켰으며, 4주후에는 모든 철분공급군에서 정상수준과 동일한 Hb수치를 나타내었다(Fig. 4).

Fig. 4. Changes in hemoglobin concentration for 4 weeks in mice. IDA: Iron-deficient anemia, Fe-NPs: Iron-nanoparticles, Fe-MPs: Iron-microparticles. Data points represent mean ± SD (n=5). †Fe-NPs group is significantly different from IDA group at P<0.05. *Fe-MPs group is significantly different from IDA group at P<0.05.

Hematocrit 수치의 변화

 Hct 수치는 IDA군에서 시간의 지속과 더불어 낮은 수치를 보였다. Fe-NPs 투여군과 Fe-MPs 투여군에서 모두 IDA군 보다 증가된 Hct값을 보였으며 2주부터는 Hct값이 유의성 있게 증가된 결과를 나타내었다(P<0.05). Fe-NPs 투여군에서 Fe-MPs 투여군 보다 1주 이후부터 그 증가율도 높고 4주 동안 수치 또한 높게 나타났다(Fig. 5). Fe-NPs 투여군에서는 4주후에 정상군의 Hct값과 유사하게 그 값이 증가되었다(Fig. 5).

Fig. 5. Changes in hematocrit value for 4 weeks in mice. IDA: Iron-deficient anemia, Fe-NPs: Iron-nanoparticles, Fe-MPs: Iron-microparticles. Data points represent mean ± SD (n=5). †Fe-NPs group is significantly different from IDA group at P<0.05. *Fe-MPs group is significantly different from IDA group at P<0.05.

TIBC의 변화

 부검 당일 복대정맥을 통해 채혈한 후 혈청을 분리해 TIBC를 측정하였다. IDA군은 0, 1, 2, 3, 4주째 정상대조군에 비해 유의성 있게 높은 수치를 나타내었다(Fig. 6). 실험 1주째부터 Fe-NPs 및 Fe-MPs 시험물질을 투여한 군에서 IDA군에 비해 유의성 있게 낮은 수치가 나타났다(Fig. 6). 실험 3주에는 Fe-NPs 및 Fe-MPs 투여군은 정상군에 비해 유의적 차이를 관찰할 수 없었다(Fig. 6).

Fig. 6. Changes in total iron-binding capacity (TIBC) for 4 weeks in mice. IDA: Iron-deficient anemia, Fe-NPs: Iron-nanoparticles, Fe-MPs: Iron-microparticles. Data points represent mean ± SD (n=5). †Fe-NPs group is significantly different from IDA group at P<0.05. *Fe-MPs group is significantly different from IDA group at P<0.05.

소장 상부에서 철분 농도의 변화

 ICP-AES의 방법을 이용하여 소장 상부 내 철의 농도를 분석한 수치를 볼 때 IDA군과 정상군을 비교해보면 전반적으로 IDA군에서 정상군보다 낮은 수치를 보였다(Fig. 7). 실험 2주 및 4주에는 Fe-NPs 및 Fe-MPs군이 정상군에 비해 높은 수치를 보였으며, 특히 2주째에는 Fe-NPs군이 Fe-MPs군보다 유의적으로 높은 수치를 보였다(P<0.05).

Fig. 7. Changes in iron contents of upper small intestine for 4 weeks in mice. IDA: Iron-deficient anemia, Fe-NPs: Iron-nanoparticles, Fe-MPs: Iron-microparticles. Data points represent mean ± SD (n=5). abcMeans not sharing common superscript letters are significantly different from each other at P<0.05.

간에서 철농도의 변화

 철분 농도는 0, 2, 4주째에 IDA군이 정상군에 비해 유의적으로 낮은 수치를 보였다(P<0.01). Fe-NPs 투여군은 2주 후에 IDA군과 유의적인 차이를 보였으며, Fe-MPs투여군도 IDA군에 비해 유의적으로 높은 철분농도를 보였다(Fig. 8). 실험 4주후에는 철분농도가 정상군과 유의적 차이를 보이지 않았다 (Fig. 8).

Fig. 8. Changes in iron contents of liver for 4 weeks in mice. IDA: Iron-deficient anemia, Fe-NPs: Iron-nanoparticles, Fe-MPs: Iron-microparticles. Data points represent mean ± SD (n=5). abcMeans not sharing common superscript letters are significantly different from each other at P<0.05.

간에서 철분에 의한 TBARS의 변화

 간에서 lipid peroxidation의 변화를 TBARS kit를 사용하여 측정하였다. 철분농도에 따라 TBARS의 농도가 다르게 나타났으며, IDA군에서 유의적으로 낮은 수치를 보였다(Fig. 9). Fe-NPs 및 Fe-MPs투여군은 2, 4주째에 IDA군에 비해 유의적으로 높은 TBARS 수치를 보였다(P<0.05). Fe-NPs와 Fe-MPs군간에는 유의적 차이가 관찰되지 않았다(Fig. 9). 실험 4주째에는 정상군과 Fe-NPs 및 Fe-MPs 투여군간에도 유의적 차이가 관찰되지 않았다.

Fig. 9. Changes in thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS) for 4 weeks in mice. IDA: Iron-deficient anemia, Fe-NPs: Iron-nanoparticles, Fe-MPs: Iron-microparticle. Data points represent mean ± SD (n=5). abcMeans not sharing common superscript letters are significantly different from each other at P<0.05.

간에서 철 염색상의 변화

 Iron-Prussian blue 염색에서 iron이 저장된 부분은 푸르게 염색 되어 나타난다(Fig. 10). Fe-NPs 투여군과 Fe-MPs 투여군에서 시간이 경과함에 따라 푸른색의 염색 성상이 증가함을 보였는데 4주째에서는 정상군과 유시한 푸른빛의 염색상 정도가 나타났다(Fig. 10). 반면에 IDA군에서는 푸른색을 띄는 염색상이 거의 나타나지 않았다(Fig. 10).

Fig. 10. Iron storage in liver. Liver was stained with the Perls' stain for iron and blue color represent iron-storage.N: Normal, IDA: Iron-deficient anemia, Fe-NPs: Iron-nanoparticles, Fe-MPs: Iron-microparticles.

비장에서 ferritin 염색상의 변화

 면역조직화학검사에 의한 ferritin heavy chain 염색에서도 갈색 빛을 띄는 염색 성상이 ferritin heavy chain이 염색된 것으로 IDA군에서는 그 염색상이 거의 보이지 않았지만, Fe-NPs와 Fe-MPs 투여군에서는 염색상이 눈에 띄게 증가하였다(Fig. 11). 실험 4주째에서는 오히려 정상군에 비하여 Fe-NPs군의 염색상이 더욱 많이 또 진하게 나타났다(Fig. 11).

Fig. 11. Ferritin storage in the spleen of mice. Brown colored spots indicate ferritin heavy chains. N: Normal, IDA: Iron-deficient anemia, Fe-NPs: Iron-nanoparticles, Fe-MPs: Iron-microparticles. Immunohistochemistry, ×100.

고 찰

 포유동물에서 철은 미량의 미네랄로서 세포기능에 지대한 영향을 미치므로 철 결핍 및 과다는 여러 질병과 관련된다[1]. 그러므로 철은 체내 항상성을 유지하기 위해 소장에서의 철의 흡수, 노쇄한 적혈구의 파괴로 부터의 철의 재사용, ferritin이나 hemosiderin으로서 철의 저장, 소장 상피세포의 탈락으로 인한 배설 등을 통하여 평형을 유지한다[3, 6, 12, 20]. 철 결핍은 개발도상국에서는 가장 흔한 영양결핍증이며 철은 선진국에서도 현재까지 여전히 결핍증이 존재하는 주요 미량 원소이다.

본 연구에서는 마우스에서 철 결핍 사료를 3주간 공급하여 IDA를 유발하고 그 후 시험물질인 Fe-NPs와 Fe-MPs를 4주 동안 매일 40 mg/kg의 용량으로 경구 투여함으로써 그 IDA의 개선 효과를 확인하고 더불어 Fe-NPs와 Fe-MPs의 개선 효과를 비교하였다. 철 결핍 사료에서 철의 농도는 정상사료 철분함량의 약 10%인 4.5 ppm으로 하였다. 시험물질 투여 후 매주 부검을 실시하여 RBC 수, Hb 농도, Hct 수치, TIBC 그리고 간과 소장의 철의 농도를 측정하였고 간 조직에 Prussian blue 염색, 비장 조직에 ferritin heavy chain 면역염색을 통하여 철 저장 정도를 알아보았다. 더불어 간에서 철분축적과 연관되어 지질과산화 정도를 측정하였다.

 Fe-NPs 투여군과 Fe-MPs 투여군에서 모두 IDA군과 비교하였을 때 실험물질투여 1-2주부터 RBC 수, Hb 농도, Hct 수치 및 TIBC의 유의적인 증가를 확인 할 수 있었다. 그러한 증가율은 Fe-NPs 투여군이 Fe-MPs 투여군에 비하여 각각의 측정시점에서 유의적이지는 않지만 높은 수치를 보였고, 시간의 경과에 따라 빠른 경향으로 정상적 수준으로 회복되는 것을 알 수 있었다. Kim et al [11]은 나노철의 흡수에 대한 효과로서 IDA 마우스에서 ascorbic acid와 병행 투여 시 RBC 수, Hb, Hct 수치를 증가시킴으로써 빠르게 빈혈개선 효과를 보였다고 보고하였다. 체내 철의 항상성은 두 가지 요인인 철 저장조절인자와 혈액생성인자에 의해 조절되는 것으로 알려지고 있다[12, 20, 21]. 체내 소장에서의 철의 흡수, 저장형으로의 변환, heme 단백질 생성, 혈구생성, 장점막 탈락, 피부, 오줌으로의 배설 등은 체내 철의 평형을 유지하는데 기여를 하고 있다[4, 13, 14]. 본 연구에서 철 결핍사료는 흡수되는 철의 양을 줄이고 체내 저장 철분의 이용을 증진시키되 차츰 시간의 경과에 따라 체내 iron store를 고갈시켜 결국엔 Hb나 heme 단백질의 생성을 억제시키며 빈혈을 유발하게 된 것으로 사료된다[2]. 본 연구에서 IDA상태에서 Fe-NPs나 Fe-MPs의 투여는 소장에서의 철의 흡수를 증가시켰다. Fe-NPs 및 Fe-MPs투여군은 2주째에 소장점막에서의 철 농도가 IDA군이나 정상군보다 매우 높은 수치를 보였다. 이것은 IDA상태에서 transferrin의 생산을 증가시켜 철분 흡수 및 운반을 증가시켜 철분 결핍성 빈혈로 부터 회복할 수 있도록 도와주는 것으로 사료된다[7, 21, 22]. 본 연구에서 transferrin의 간접 측정 수치인 TIBC의 수치가 초기 높은 수치를 보이다가 투여시간의 경과에 따라 정상군의 수치와 유사하게 낮은 수치를 나타내었다. 이것은 Fe-NPs 및 Fe-MPs 투여 후 철분 흡수 및 축적의 증가와 함께 TIBC의 감소는 체내 철분 요구량의 감소와 밀접하게 연관되었을 것으로 사료된다. 더욱이 소장에서 철의 흡수증가는 erythropoiesis에 대한 기능적 철로서 작용하여 RBC생성, Hb농도, Hct 수치를 증가시켰을 것으로 사료된다[20, 22].

 Hb 농도는 일반적으로 철을 경구 투여한 1-2주 후부터 그 수치가 증가하기 시작한다. 이 실험에서도 Fe-NPs와 Fe-MPs 투여 후 1주부터 IDA군에 비해 유의적인 증가를 보였다. 그러나 Fe-NPs 투여군과 Fe-MPs 투여군 간의 비교에서는 유의적인 차이를 확인할 수 없었다. RBC 수나 Hct의 경우도 Fe-NPs 투여군과 Fe-MPs 투여군 간의 유의적인 차이는 볼 수 없었다. 그러나 이러한 혈액학적 수치의 증가경향에서 Fe-NPs군이 Fe-MPs군보다 빠르게 정상수치에 접근하였다. 이러한 결과는 Fe-NPs와 Fe-MPs 모두 혈구 생산에 기여하여 빈혈을 개선하지만 Fe-NPs가 Fe-MPs 보다 더 빠르게 혈구를 생산하게 하여 빠른 빈혈 치료효과를 나타낸다고 볼 수 있다. 즉, 생체이용률 측면에서 봤을 때 Fe-NPs가 Fe-MPs보다 높다는 의미로 볼 수 있다. 적혈구의 파괴와 생성은 체내 대부분 철의 대사 회전율에 영향을 준다. 적혈구는 총 체내 철의 약 2/3를 차지하며 약 120일의 수명을 가지고 있다. 따라서 성인의 경우 적혈구의 1/120을 새로 교환하기 위한 철 대사 회전량은 하루에 약 20 mg이다. 그러나 분해된 적혈구 중 대부분의 철은 Hb의 합성을 위해 다시 이용된다[1, 3, 23].

 철분의 흡수과다에 의한 과잉 철은 저장형으로 주로 간에서 축적된다[10]. 본 연구에서 실험 2주 후에 간의 철 농도가 IDA군에 비해 유의적으로 높았으나, 아직 정상군에 비해서는 유의적으로 낮았다. 실험 4주째는 간에서 철분의 저장 및 비장에서 ferritin 축적이 정상군과 유사한 수준으로까지 관찰되었다. 철은 간에서 주로 간 실질세포에 축적되며 세망내피세포나 쿠퍼(Kupffer)세포에는 적은 양만 저장되지만, 골수와 비장에서는 철은 주로 세망내피세포 내에 저장된다[4, 5]. 저장 철은 주로 Hb합성에 필요한 세포의 철 요구를 충족시키기 위한 저장소로 작용하며 ferritin에 결합된 철은 hemosiderin에 결합된 철보다는 더 쉽게 유출되어 사용된다[3, 12].

 본 연구에서 시험 4주째 Perls’ stain의 염색상 관찰에서 Fe-NPs 투여군과 Fe-MPs 투여군의 염색상이 정상군에 비해 푸른색이 진하고 많이 나타났다. 이것은 빈혈 상태에 처한 개체는 철의 흡수율과 저장 정도를 생리적인 반응으로 증가 시키는데 이러한 이유로 간의 철의 농도가 정상군에 비해 높게 나타난 것으로 보인다. 더욱이 IDA상태에서 철 흡수 기전을 빠르게 가동시켜 체내 항상성 유지를 위해 과잉 흡수된 철을 간에 저장한 것으로 사료된다. 또한 본 연구에서 Fe-NPs는 Fe-MPs에 비해 소장 상부에서 크게 흡수율이 증가되었다고는 단정 짓기 어려우나 간에 저장되고 이용되는 정도가 Fe-MPs에 비해 높아 동일한 양이 흡수되었다 하여도 이용률에서 높으므로 더욱 효과적으로 사용되었다고 할 수 있다. 본 연구에서 방법적으로 Fe-NPs와 Fe-MPs의 흡수의 차이를 확인 하지 못하였고, 또한 hepcidin이라는 철분 조절 hormone에 대한 측정이 이루어지지 않았다. 따라서 Fe-NPs의 흡수 및 생체 이용 관련 분자생물학적 철분조절 인자와의 연관성에 대하여 더욱 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다.

 철은 전이 금속으로 산화적인 상태에서 발견되며, 철의 생물학적인 활성을 제어하기 위해 단백질과 결합하여 존재하는데, 이러한 단백질에는 Hb, transferrin과 ferritin이 있다[5]. 하지만 이렇게 결합된 철은 내인적으로나 외인적으로 체내에 유해한 반응을 발생 시킬 수 있다[24]. 철에 의한 가장 유해한 반응은 Fenton reaction에 의한 free radical의 생산인데 이는 hydroxyl radical을 생산하는 산화촉매제로 작용한다. Free radicals는 염색체를 손상시켜 종양발생을 촉진하며 세포내의 항산화 효소와 scavenger와 같은 항암물질을 고갈시킨다[25, 26]. 본 연구에서 간에서 철의 축적이 조직손상의 지표인 lipid peroxidation에 어떻게 영향을 미쳤는지를 알아 보기위해 TBARS를 측정하였으며, 이러한 TBARS 수치는 간의 철분농도와 비례하여 높게 나타났다. IDA군은 시험기간 내에 낮은 TBARS 수치를 보였고, Fe-NPs 및 Fe-MPs는 4주째에는 정상군과 유사한 수치를 보였다. 이러한 결과는 간조직의 저장된 철이 간조직의 homogenization과정 등의 TBARS 측정을 위한 처리 시 free radicals의 생성에 기인하여 TBARS 형성을 촉진한 것으로 사료된다.

 본 연구에서 나타난 결과로서 나노철의 경구투여는 비나노철과 유사한 IDA 개선효과를 보였으며 체중 및 장기무게의 변화나 조직학적 관찰에 있어서 정상군과 유의적 차이가 발견되지 않았다. 이것은 나노 철의 독성이 본 연구에서 이러한 지표들에 의해 나타나지 않았음을 의미한다. 더불어 IDA 개선효과의 효율적인 면에서 나노철이 마이크로사이즈의 철보다 빠르게 호전시키는 결과를 얻었다. 그러므로 나노철의 경구투여가 식이성 빈혈 치료제로 또는 다른 질병의 치료 및 연구에 활발하게 이용 될 수 있으리라 생각한다.

감사의 글

 본 연구는 논문은 2011년도 정부(교육과학기술부)의 재원으로 한국연구재단 기본연구지원사업(2011-0012626)에 의해 지원되어 수행되었습니다.

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