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ISSN : 1976-7447(Print)
ISSN : 2287-7363(Online)
Journal of Biomedical Research Vol.14 No.1 pp.28-34
DOI : https://doi.org/10.12729/jbr.2013.14.1.28

Anti-diabetic effect of acid hydrolyzed silk peptides via cytoprotection of pancreas β-cells and up-regulation of glucose uptake in muscle cells

Seong Soo Joo*
Department of Marine Molecular Biotechnology, College of Life Science, Gangneung-Wonju National University, Gangneung 210-702, Korea
Received 20 Feb. 2013, Revised 7 Mar. 2013, Accepted 11 Mar. 2013

Abstract

In this study, we observed anti-diabetic effects of acid hydrolyzed silk peptides, where the amount of peptides in the total amino acid mixture was strictly regulated. Using in vitro diabetes models, silk peptide-containing amino acid mixtures of 5.60% (G5), 11.30% (G10), 14.50% (G15), and 20.50% (G20) were examined separately in order to determine whether they have biological activities. According to our results, a cytoprotective effect was observed following treatment of interleukin-1β in RINm5f pancreas β-cells. As a consequence, Bax, a pro-apoptotic gene, was down-regulated, while Bcl-2, a pro-survival gene, was retained at normal level. Results of the 4’,6-diamidino-2-phentylindole (DAPI) staining assay confirmed that G20 has a better cytoprotective effect. Insulin release from RINm5f cells showed a significant increase following treatment with G5-G20, suggesting that silk peptide effectively regulated and induced insulin production. Single treatment with G5-G20 resulted in enhanced glucose uptake in L6 skeletal muscle cells. In addition, a higher amount of each group inhibited the activity of α-glucosidase. In summary, these data suggest that silk peptide may have an anti-diabetic effect through protection of pancreas β-cells and enhancement of insulin release, which showed a close association with Type 1 diabetes mellitus (DM), and can improve glucose uptake, which was the major target for therapy of Type 2 diabetes. Taken together, we concluded that acid hydrolyzed silk peptides can be used effectively for control of blood sugar metabolism via improvement of the problematic indices of Type 1 and Type 2 DM.

14(1)_6.주성수교수님_130326.pdf1.89MB

Introduction

 당뇨병은 인슐린의 절대적 결핍 또는 상대적 결핍에 의한 탄수화물, 지방, 단백질 등의 만성적인 대사 장해와 그에 따른 만성적인 혈관 손상을 특징으로 하는 대사이상 질환이며, 최근 성인 및 소아당뇨가 급격히 증가 추세에 있어 사회적 문제로 대두되고 있다. 당뇨병은 발생 기전에 따라 크게 인슐린 의존형 당뇨(제1형 당뇨병, type 1)와 인슐린 비의존형 당뇨(제2형 당뇨병, type 2)로 나뉘며 췌장 베타세포의 손상으로 인슐린 분비가 일어나지 않는 type 1과, 인슐린 분비는 원활하나 인슐린 저항성에 의한 포도당(glucose) 유입이 target 세포로 잘 일어나지 않는 type 2가 있다[1, 2]. Type 1은 자가면역 질환으로서 면역세포인 T 세포와 대식세포의 췌도내 침윤으로 점차 인슐린 분비세포인 췌장 베타세포의 손상이 촉발되어 나타난다[3]. 이 과정에서 베타세포는 면역세포에 의해 직접 파괴되거나, 각 세포에서 분비되는 사이토카인(i.e. interleukin-1 beta, IL-1β), nitric oxide (NO), reactive oxigen species (ROS) 등에 의해 손상을 받기도 한다[1]. 특히 type 2의 경우 고혈당이 공통적 요소로 보이나 다양한 원인에 의한 질환군이며, 이중 비만과 낮은 수준의 염증이 type 2 발생과 밀접한 관계를 나타낼 뿐 아니라, 서구화된 식이습관에 따라 급증 추세인 소아비만이 전체 당뇨 유병율을 배가시키고 있다[4]. 당뇨병의 치료법은 type 1 또는 type 2에 따라 다르게 처치되는데, type 1에서는 인슐린 투여가 가장 주된 치료법이며, type 2의 경우 식이 및 운동요법을 통한 인슐린 저항성 감소를 줄이는 데에 주안점을 두고 있다. 하지만 적극적인 치료법으로서 sulfonylurea, non-sulfonylurea, metformin, alpha-glucosidase inhibitor 및 thiazolidinedion 등의 경구용 혈당강하제가 사용되고 있다[5]. 더불어 당뇨병과 같은 대사성질환의 유효한 치료제로서 천연물질에 대한 연구가 다양하게 수행되고 있다(황련유래 berberine, 오렌지 및 포도유래 naringenin, 울금유래 curcumin 등) [6].

최근 기능성 소재로서 실크펩타이드가 주목을 받고 있는데, 이는 천연에서 얻을 수 있는 100% 거대 단백질이기 때문이며, glycine, alanine, serine 등을 다량 함유한 18종의 천연 아미노산을 함유하고 있기 때문이다[7]. 본 연구에서는 누에고치(silkworm cocoon, Bombyx mori)로부터 산 가수분해 방법과 가수분해 시간 및 온도를 제어하여 함량이 조절된 올리고 펩타이드를 실험재료로 사용하여 type 1 및 type 2 항당뇨 효능을 확인하고자 하였다.

Materials and Methods

실크펩타이드 시료 준비

 실험물질은 월드웨이(주)로부터 공급받아 사용했으며, 시료의 준비 예는 다음과 같다. 가잠(Bombyx mori)의 누에고치 또는 부잠사로를 정련하여 세리신을 제거한 원료를 확보하여, 식품공전 기준, 규격 및 판정을 통과한 정련한 원료를 가수분해 탱크에 투입하고 규정농도의 HCl 용액에서 100~120°C에서 24~48 시간 가수분해 한 후 NaOH 용액(pH 5.5~6.5)으로 중화하였다. 탈색 및 탈취를 위해 활성탄 처리를 한 후 중화 시 생성된 NaCl을 0.3% 이하로 제거하였고 약 20~30 brix로 농축하였다. 실험에 사용하기 위해 분무건조 후 시작용량(100 mg/mL)을 3차 증류수로 용해하여 실험 전까지 −80°C에서 보관하였다. 본 공정을 통해 펩타이드 함량이 조절된 4가지의 시료(5.60%-G5, 11.30%-G10, 14.50%-G15, 20.50-G20)를 준비하였으며, 각 펩타이드 %함량 별 유리아미노산은 각각 89.2%, 84.1%, 81.3% 및 75.5%로 확인되었다.

세포배양

본 연구에서는 인슐린 분비세포인 췌장 베타세포주 (RINm5f, ATCC, USA)와 골격근세포주(L6, KCLB, Korea)를 사용하였다. 각 세포주는 10% fetal bovine serum을 포함한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) (Hyclone, USA) 또는 Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium (Hyclone)을 사용하여 37°C, 5% CO2로 조정된 CO2 배양기에서 배양하였다. 세포가 90% 성장이 되었을 때 실험에 사용하였으며, 20 passage가 넘지 않도록 조절하였다. 배양된 세포는 0.25% trypsin-EDTA로 부유 시킨 후 혈구계산기로 세포 수를 산정하였다. 세포독성 시험은 배양된 세포를 96 well plate 에 1.0 × 104 cells/well이 되도록 하였고 유전자발현 시험은 6 well plate에 1.5 × 106 cells/well이 되도록 분주하여 2 시간 선 배양 후 본 실험에 사용하였다. 

세포독성 측정

 각 시료(G5, G10, G15, G20)에 의한 췌장 베타세포의 세포보호 유무를 확인하기 위하여 세포막 손상에 따라 배지로 유출된 lactate dehydrogenase (LDH)량을 측정하는 LDH release assay (CytoTox 96 Kit, Promega, USA) 를 수행하였다. RINm5f 세포주 1.0 × 104 cells/well은 96 well plate에 분주와 함께 2시간 선 배양 후 각 시료 100 μg/mL을 처리하고, RINm5f 자극을 위해 IL-1β (10 ng/mL)을 각각 처리하여 37°C, 5% CO2 incubator에서 24 시간 동안 배양하였다. LDH 측정을 위해 배양액을 새로운 96-well plate에 50 μL 분주하고, 동량의 LDH reagent 를 50 μL씩 첨가하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 반응 종료 후 stop solution 동량을 첨가하여 반응을 중지 시킨 후, ELISA reader (Molecular Devices, USA)를 이용하여 490 nm에서 측정된 흡광도 상대수치를 대조군(무처치군) 대비 세포독성(%)으로 표시하였다. 사전연구에서 각 시료의 최대용량 150 μg/mL에서 독성이 관찰되지 않아 100 μg/mL을 적정 유효용량으로 사용하였다.

DAPI 형광염색

 4’,6-diamidino-2-phentylindole (DAPI) 형광염색은 세포의 핵 내 chromosome 을 염색하여 형광 현미경 하에서 관찰하는 방법으로 정상적인 세포에서는 원형의 온전한 핵 모양이 관찰되는 반면 손상된 세포에서는 핵의 응축(condensation) 및 분절(fragmentation)이 관찰된다. Stock solution으로서 DAPI 2 mg/mL을 증류수에 용해한 후 −20°C에서 보관하였다. 염색 시 세포가 분주된 chamber slide에 각 군 별로 적정한 약물을 처리하고 배양한 후 stock solution을 1X phosphate buffered solution (PBS) 에 1:500 (4 μg/mL in PBS)로 희석하여 암실환경에서 약 5 분간 염색하였다. 염색 종료 후 1X PBS로 5분간 2회 세척한 뒤 형광 현미경(Nikon ECLIPSE Ti-S, Japan)하에서 관찰하였다.

인슐린분비 측정

 인슐린 분비세포주인 RINm5f 5.0 × 105 cells/well을 6-well plate에 분주하고 각 시료 100 μg/mL 및 glucose (Sigma-Aldrich, USA) 10 μM 처리 후 48시간 배양하였다. 반응 종료 후 배양액에 존재하는 인슐린의 양을 Insulin ELISA kit (Alpco, USA)의 매뉴얼에 따라 반응 결과물에 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) 기질 처리 및 반응종료 후 흡광도 450 nm에서 측정하였다.

Glucose uptake 측정

Glucose uptake 실험은 세포 내로 유입되는 glucose 탐색에 민감한 probe로서 fluorescent 2-deoxyglucose analog 인 2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diaxol-4-yl) amino]-2-deoxyglucose (2-NBDG) (Molecular Probes, USA)를 이용하여 형광현미경(exitation/emission = 448/540 nm) 하에서 관찰하였다. 골근육세포주인 L6 세포의 농도를 1.5 × 104 cells/mL로 계수하여 chamber slide (1.8 cm2  /well, Nunc, USA)에 분주한 후 각 시료 단독(100 μg/mL) 또는 인슐린(0.4 mM)을 처리하였고, glucose-free media에서 24 시간 배양하였다. 반응종료 후 10 μM 2-NBDG로 30분간 염색 후 1X PBS로 2회 세척하고 4% paraformaldehyde로 고정하여 형광현미경으로 관찰하였다. 

Quantitative real time polymerase chain reaction (qPCR) 분석

 각 군의 세포로부터 Trizol Reagent (Invitrogen, USA) 를 이용하여 total RNA를 추출하였다. 즉, Trizol reagent 1 mL를 첨가하여 세포를 용해시키고 실온에서 5분 동안 방치 후 chloroform 200 μL를 첨가하여 13500 rpm에서 15분 동안 원심분리 하였다. 투명한 상층액(500 μL)을 취하여 새로운 tube로 옮기고 동량의 isopropyl alcohol을 첨가한 후 13500 rpm에서 10분 동안 원심분리 하여 RNA 를 침강시켰다. RNA pellet을 DEPC 처리한 증류수로 희석한 70% EtOH 0.75 mL로 세척한 후 공기 중에서 건조시켜 reverse transcription sample로 사용하였다. First strand cDNA 합성은 추출된 total RNA 1 μg을 사용하여 수행되었고, Improm-II reverse transcription system (Promega)과 oligo dT primer를 사용하여 역전사 반응을 수행하였다. qPCR 분석은 Rotor-Gene 6000 (Qiagen, USA)을 사용하였으며, Table 1의 primer를 이용하여 Bcl-2, Bax 및 GLUT4 유전자의 발현을 정량적으로 측정하였고 β-actin에 normalization시킨 상대 수치를 비교분석 하였다 [8].

Table 1. Primer sequences used for qPCR

α-glucosidase 활성저해

 배당체를 분해하는 효소인 glucosidase의 활성저해를 측정하여 각 시료의 항당뇨 효과를 측정하고자 하였다. 본 실험에서는 0.15 U/mL α-glucosidase (Sigma-Aldrich), 200 mM potassium phosphate buffer, 3 mM nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG, Sigma-Aldrich) 및 0.1 M sodium carbonate solution (Sigma-Aldrich)을 이용하여 수행하였다. 즉, 시료 50 μL에 buffer 50 μL와 enzyme 50 μL를 넣고 37°C에서 15분간 반응시킨 후, 기질용액(3 mM pNPG 용액) 100 μL를 첨가하고 37°C에서 10분간 반응시켰다. 양성대조군으로서 α-glucosidase inhibitor, acarbose를 사용하였고, 0.1 M의 Na2CO3을 첨가하여 반응을 멈춘 후 405 nm에서 흡광도를 측정하여 아래의 식으로 효소 저해활성을 분석하였다.

 

통계처리

 결과분석은 GraphPad Prizm 5.01 software를 이용하여 통계 처리하였다. 결과는 각 군별 mean ± S.D.로 나타내었고 각 실험군간 비교는 one way ANOVA로 분석한 후 Duncan’s multiple range tests로 P<0.05 수준에서 검증하였다.

Results

실크펩타이드의 췌장 베타세포 보호효과

 췌장 베타세포의 직접적인 손상은 인슐린의 절대적 부족현상을 초래하여 Type 1 당뇨를 유발하므로, 본 실험에서는 세포막 손상에 따라 배지로 유출되는 LDH의 수준을 측정하였고, 아포토시스(apoptosis) 조절 단백질을 인코딩하는 Bcl-2 (pro-survival) 및 Bax (pro-apoptosis) 유전자의 발현수준을 qPCR을 통해 비교분석 하였다. 실험결과 실크펩타이드 전체에서 IL-1β 단독처리 군에 비해 유의하게 LDH 분비가 감소하였고(Fig. 1A), pro-survival 유전자인 Bcl-2가 실크펩타이드 처리 시 IL-1β 단독 처리군에 비해 유의한 발현을 한 반면(Fig. 1B), pro-apoptosis 유전자인 Bax는 G5를 제외한 전체군에서 유의하게 발현이 감소하였다(Fig. 1C). 췌장 베타세포에 대한 DAPI 염색 측정 결과 펩타이드의 함량이 증가할수록 세포보호 효과가 뛰어난 것으로 확인되어(Fig. 2), 세포독성과 세포사관련 유전자 발현 결과의 일치성을 고려할 때 실크펩타이드의 함량 증가시 보다 우수한 Type 1 항당뇨 효과를 나타낼 것으로 사료되었다.

Fig. 1. IL-1β-induced cytotoxicity and apoptosis-associated gene expression in pancreas beta cell line (RINm5f). Cells were seeded on 96-well (LDH assay) or 6-well plate (gene expression) at appropriated cell numbers described in Materials and Methods, and incubated for 24 hr after the treatment of 100 μg/mL silk peptides (G5 to G20). IL-1β (10 ng/mL) was used for the induction of apoptosis. (A) %cytotoxicity of LDH release. (B-C) mRNA expression of Bcl-2 and Bax in qPCR analysis. Results were internally confirmed by the comparative cycle count against β-actin as the standard gene. Experiments were performed in triplicate, and the results are expressed as the mean ± S.D. *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001 vs. positive control (IL-1β group).

Fig. 2. DAPI nucleic acid stain in RINm5f cells. Cells were seeded on chamber slide and treated with G5, G10, G15 and G20, followed by IL-1β (10 ng/mL) post-treatment, and cultured for 24 hr. DAPI staining was performed as described in Materials and Methods, and analyzed using Nikon ECLIPSE Ti-S fluorescence microscopy. Magnification = 200X.

실크펩타이드의 인슐린 분비 및 glucose uptake 촉진

 본 실험에 사용된 실크펩타이드의 인슐린 분비 및 glucose uptake 촉진소재로서 잠재성을 확인하기 위해 인슐린분비 세포주인 RINm5f 세포주에 각 시험물질(G5~G20)을 처치 후 48시간 내 배지로 분비된 인슐린의 양을 측정하였다. Fig. 3A에서 나타난 바와 같이 양성대조군으로 사용된 glucose 처치 시 무처치 대조군에 비해 약 3배의 인슐린 분비 촉진효과가 있었으며 실크펩타이드 전체군에서 무처치 대조군에 비해 약 2.5배~4배의 농도 증가가 관찰되었다. 특히 펩타이드 함량이 가장 높은 G20의 경우 매우 효과적으로 인슐린 분비를 촉진하는 것으로 나타나 펩타이드의 함량이 주요한 효능의 배경일 것으로 사료되었다. 반면 혈중 glucose를 조직세포 내 유입을 돕는 막 단백질인 glucose transporter type 4 (GLUT4)의 유전자 발현수준은 실크펩타이드 전체군에서 유의한 증가를 보였으나, 펩타이드의 함량이 낮은 G5에서 보다 우수한 결과가 예상되었다(Fig. 3B). 흥미롭게 실크펩타이드 단독 처치 시에도 근육세포주인 L6 세포로의 glucose 흡수가 관찰되어 실크펩타이드에 의한 glucose 흡수개선이 나타날 것으로 판단되었다(Fig. 3C).

Fig. 3. Measurement of insulin release in RINm5f cells and analysis of glucose transportation in L6 skeletal muscle cells. (A) measurement of insulin release by each silk peptide group after 48 hr incubation. Glucose (10 μM) was used as a positive control. (B) mRNA expression of GLUT4 in qPCR analysis. Results were internally confirmed by the comparative cycle count against β-actin as the standard gene. (C) glucose uptake analysis by 2-NBDG staining in L6 cells in the presence or absence of insulin with each silk peptide. Glu, glucose.

실크펩타이드의 α-glucosidase 활성저해효과

 실크펩타이드(G5, G10, G15 및 G20)에 의한 α-glucosidase 활성 억제능을 측정하였다(Fig. 4). 각 군의 처리 용량을 0.01~100 μg/mL의 범위로 확대하여 군별 농도 의존성을 확인하고자 하였다. Figs. 4A~4D에 나타난 바와 같이, 고용량 100 μg/mL에서 α-glucosidase 활성저해효과를 보이는 것으로 확인되었으나, 100 μg/mL 이하에서는 효소활성 저해가 나타나지 않았다. 이러한 결과로부터 실크펩타이드에 의한 α-glucosidase 활성억제는 펩타이드 함량의 차이보다는 각 군의 전체 아미노산 총량과 연관되어 있음을 시사하였다.

Fig. 4. Percentage of α-glucosidase inhibition by silk peptides. α-glucosidase inhibition by each silk peptide was assayed at varying amount of G5, G10, G15 and G20 (0.01 to 100 μg/mL) as described in Materials and Methods. Experiments were performed in triplicate, and the results are expressed as the mean ± S.D. Acar, 100 μM acabose.

Discussion

 자연계에는 20가지의 아미노산이 존재하며 이중 12가지(glycine, alanine, arginine, asparagine, aspartate, cysteine, glutamate, glutamine, histidine, praline, serine, tyrosine)는 우리 몸에서 합성이 가능하고 나머지 8가지(isoleucine, leucine, lysine, tryptophan, valine, methionine, phenylalanie,threonine)는 합성이 되지 않아 음식을 통해 꼭 섭취해야 하는 필수 아미노산이다. 최근 이러한 아미노산의 중요성이 당뇨 및 당뇨합병증의 예방에 주요 연구대상으로 떠오르고 있다[9]. 특히 alanine과 glycine은 췌장 베타세포의 막 전위를 변화시켜 인슐린 분비를 증가시키는 작용을 하는 것으로 보고되고 있다[10, 11]. 또한, van Loon등은 만성 Type 2 당뇨병 환자에게 유리아미노산/단백질 혼합체를 투여했을 때 인슐린 분비가 증가함을 밝혀 섭취되는 아미노산의 함량 및 조성이 당뇨병환자에게 효과적임을 시사하였다[12]. 이러한 관점에서 아미노산의 섭취는 당뇨병과 같은 성인병 발생을 억제하는 기능성 물질로의 개발이 가능할 것이다. 실크는 천연유래의 거대 단백질이며 누에로부터 얻어지는 물질로 불용성인 세리신(25%)과 가용성인 피브로인(75%) 두 단백질로 구성된 천연고분자 물질이다[13]. 특히 실크는 glycine-alanine-glycine-alanine-glycine-serine (GAGAGS)의 반복서열을 가지는 고분자 단백질로서 체내 흡수를 용이하게 하기 위해서는 저분자 단백질로 가수분해가 요구되며 방법으로는 효소를 이용한 가수분해와 산분해법이 사용될 수 있다[14]. 종래 실크 가수분해물은 실크의 가수분해방법 및 잔류물을 여과하는 방법에 따라 아미노산의 조성 및 올리고 펩타이드의 분량에 차이가나며 따라서 실크 가수분해물 특유의 생리활성도 목적과 다르게 나타날 수 있다[15]. 본 연구에 사용된 실크펩타이드는 대량생산이 가능한 산가수분해법으로 가수분해시간, 온도를 정밀하게 제어하여 조절된 올리고 펩타이드의 함량별 항당뇨 활성 차를 분석하고자 하였다. 실험에 사용된 시료는 각 그룹별 유리아미노산과 펩타이드의 함량의 비가 달라 각 조합간 효능의 차이가 있을 것으로 예상되었으며, 유리아미노산:펩타이드의 함량 비(%)는 각각 89.2:5.6 (G5), 84.1:11.3 (G10), 81.3:14.5 (G15) 및 75.5:20.5 (G20)로 확인되었다. 전체 군의 세포독성은 고농도에서 관찰되지 않아 용량선정의 범위가 다양할 것으로 사료되었고, 특히, 췌장 베타세포에 IL-1β를 처치하여 세포사를 유발하는 모델에서 펩타이드의 함량이 높을수록 보다 유의한 세포보호 효과가 관찰되었다. 이와 같은 세포보호 효과는 세포사관련 유전자인 Bcl-2와 Bax의 발현 수준을 분석할 때 일관된 결과를 나타내었다. 즉, pro-survival 유전자인 Bcl-2의 발현이 정상 무처치 군과 유사하게 나타나는 반면, pro-apoptosis 유전자인 Bax의 경우 IL-1β 단독 처치 군에 비해 유의한 수준으로 발현이 감소하는 결과를 보여 실크펩타이드에 의한 세포보호 효과를 확인하였다. 또한 세포손상 시 나타나는 DNA 분절을 확인하기 위해 수행한 DAPI 형광염색결과 펩타이드 용량이 증가할수록 보다 효과적으로 세포보호가 일어남을 확인하였다. 이러한 결과로부터 실크펩타이드가 인슐린 의존성 Type 1 당뇨병의 주 원인인 췌장베타세포를 보호하여 항당뇨 효능을 가질 것으로 사료되었으며, 이는 peptide-based 특성에 따른 calcium channel blocking등에 의한 세포보호 효과가 주 기전인 것으로 생각된다[16]. 인슐린 분비세포주인 RINm5f 베타세포에 G5, G10, G15 및 G20을 처리하였을 때 양성대조군인 glucose 처리군에 필적할만한 인슐린 분비효과를 나타내어 실크펩타이드 단독 처치로도 효과적으로 인슐린 분비를 유도하였으며, 펩타이드 고함량에서 매우 효과적인 결과가 도출되었다. 이는 실크펩타이드의 주요 아미노산 성분인 alanine과 glycine에 의한 세포 탈분극 유도와 인슐린 분비를 강력하게 조절하는 arginine에 의한 복합 효과인 것으로 보이며, 따라서 펩타이드 함량이 높은 G20에서 보다 효과적인 인슐린 분비를 유도하는 것으로 생각된다[17]. 혈중 glucose uptake가 일어나는 말초조직의 근육조직세포모델로서 L6 세포주에 각 시험물질을 처치하였을 때 G5군에서 glucose 운반 단백질인 GLUT4의 발현을 유의하게 증가시켰으며, 타 군에서도 유의한 수준의 발현 증가는 나타났으나, G5군에 비해 낮은 발현 수준을 나타내었다. GLUT4 인슐린 의존성 glucose 운반의 세포내 주요 단백질로 알려져 있어 GLUT4 유전자의 증가는 효과적인 glucose uptake를 예측할 수 있다18]. Glucose의 이동성을 탐색할 수 있는 2-NBDG 염색결과 실크펩타이드 단독처치 시 무처치 정상군에 비해 세포로의 glucose uptake가 관찰되어 실크펩타이드에 의한 glucose uptake 효과가 있는 것으로 확인되었으며 인슐린과의 병용 투여시 시험물질의 효과에 의한 인슐린 처치 농도의 감소효과도 기대되었다. 이는 인슐린 수용체의 반복구조인 Gly-X-Gly-X와 실크펩타이드(피브로인)의 반복구조인 Gly-Ala-Gly-Ala의 반복구조와의 구조적 혼동의 가능성에 의한 효과도 배제할 수 없으며, 피브로인 실크펩타이드 유래 합성펩타이드인 Gly-Ala-Gly-Val-Gly-Tyr의 실험에서 glucose 수송과 지질대사 개선이 효과적인 것으로 나타나 본 실험에서 확인된 근육세포주에서 glucose uptake의 효과는 펩타이드와 인슐린 수용체와의 연관성을 암시하고 있다[19]. 실험의 결과를 토대로, 실크펩타이드에 의한 항당뇨 효능은 췌장 베타세포 보호효과 및 인슐린 분비 증가에 의한 Type 1 당뇨병과 함께 glucose의 효과적인 uptake에 의한 Type 2 당뇨병에 효과적인 기능성소재로서의 개발 가능성이 매우 높을 것으로 사료되며, 펩타이드 함량의 조절에 의한 용량의존성 여부를 감안할 때 항당뇨 개선제로서의 적용범위가 확대될 수 있을 것으로 사료된다.

Acknowledgements

 이 논문은 2011년도 강릉원주대학교 학술연구조성비지원에 의해 수행되었기에 이에 감사 드리며, 제반 연구 지원 및 물질제공에 협조를 해 주신 월드웨이(주) 및 관계자님께 감사 드립니다.

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