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ISSN : 1976-7447(Print)
ISSN : 2287-7363(Online)
Journal of Biomedical Research Vol.14 No.2 pp.83-90
DOI : https://doi.org/10.12729/jbr.2013.14.2.83

Screening of functional components derived from fresh water laver, Prasiola japonica, and its pharmacological properties

Seong Soo Joo1 *, Da Woom Seo1, Hee Jung Kim1, Su Kil Jang1, Mansig Jun2
1Department of Marine Molecular Biotechnology, College of Life Science, Gangneung-Wonju National University, Gangneung 210-702, Korea
2Research Institute for Gangwon, Chuncheon 200-041, Korea
Received 20 May 2013, Revised 30 May 2013, Accepted 7 Jun. 2013

Abstract

The aim of the current study was to analyze the active ingredients and to screen the pharmacological properties of freshwater laver, Prasiola japonica, the only species grown in Korea. According to results of gas chromatography-mass spectrometry assay, components from P. japonica were more diverse than those from sea laver. Of particular interest, our results indicated that ethanol extract of P. japonica (PJE) contained loliolide, sorbitol, mannitol, and alverine, which were known to have an anti-oxidant, anti-oral microbial, osmotic diuresis, and smooth muscle relaxant, respectively. In addition, five solvent fractions of PJE (water, butanol, chloroform, ethyl acetate, and hexane) significantly inhibited the production of lipopolysaccharide-induced nitric oxide and a higher amount (>100 μg/mL) of chloroform, ethyl acetate, and hexane fraction were considered to play a specific role in cancer cell death. PJE and its solvent fractions found to be effective scavengers of free radicals, particularly, hydroxyl radicals. Glucose uptake in L6 myoblast cell line that stably expresses the glucose transporter type 4 (GLUT4) proteins was also remarkably enhanced upon treatment with solvent fractions, remarkably chloroform fraction. Taken together, we concluded that P. japonica may have potent pharmacological properties and thus contribute to development of novel natural candidates for various disease targets.

14(2)_6.주성수교수님.pdf1.74MB

Introduction

 우리가 식용으로 섭취하는 김(Porphyra)은 보통 바다에 분포하는 해조류의 일종으로서 홍조식물 보라털목 보라털과에 속하며 바다의 암초에 이끼처럼 붙어서 자라는 특징이 있다[1]. 우리나라를 포함한 일본 등지에서 자연번식만으로는 그 수요를 충족시킬 수 없어 주로 양식을 통하여 공급되고 있으며, 현재 국내에서 주로 양식되고 있는 김은 방사무늬김(P. yeoensis Ueda)을 주류로 하여 참김(P. tenera Kjellman), 모무늬돌김(P. seriata Kjellman) 및 잇바디돌김(P. dentata Kjellman)등 4종이다[2]. 홍조류(red algae, Phylum Rhodophyta)인 바다김 과는 달리 녹조류(green algae, Phylum Chlorophyta)인 Prasiola japonica Yatabe는 바다가 아닌 소하천에서 생육하며 민물파래과(Prasiolaceae)에 속한다[3]. P. japonica(이하 민물김)는 예로부터 물김 또는 민물김으로 구전되어 왔으며, 현재는 인근 주민과 보도 매체를 통해 민물김으로 알려져 있는 상황이나 아직까지 국명에 대한 분명한 분류학적 처리가 이루어지지 않은 실정이다. 이와 유사하게 일본에서는 민물김을 카와노리(カワノリ, 하천김)라는 이름으로 부르고 있다. 우리나라 민물김은 1938년 일본 학자인 Okada가 함경남도 문천군 문천면에서 최초로 채취하여 Prasiola formosana var. coreana Okada로 명명하여 발표한 것이 효시이며[4], Park 등[3]에 의해 삼척군의 집단에 대한 형태 및 생태학적 연구가 수행된 바 있다. 이처럼 우리나라의 민물김은 일본에 분포하는 것과 다른 분류군으로 인정되어 왔으나[3, 4] 본 연구를 위한 선행연구 결과(data not shown) 일본산 P. japonica와 매우 높은 유전적 상동성을 보이는 것으로 평가되어 동일 분류군일 가능성이 제기되었다. 우리나라에서는 산업화에 따른 인위적 영향으로 40여년전에 이미 사라진 종으로 알려졌으나 아직 강원도 삼척시의 소한천에 민물김이 분포하고 있음이 밝혀졌다. 참김 및 돌김과 같은 홍조류는 인간이 오랫동안 이용해온 대표적인 해양자원이며, 유용 성분으로 mannan, xylan 등의 난용성 섬유와 항산화작용을 하는 porphyran 등과 같은 수용성 다당류 및 혈중 콜레스테롤을 낮추는 작용을 하는 taurine 등이 풍부한 것으로 알려져 있다[5, 6]. 또한 민물김과 같은 녹조류(Prasiola stipitata, Enteromorpha linza 등) 유래 추출물이 항고혈압 및 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA)에 의한 자외선 차단 등의 활성을 가지는 것으로 보고되었다[7, 8]. 한편 일본에서 민물유래 식용김으로 사용하고 있는 스이젠지노리 (Suizenzinori, Aphanothece sacrum)에는 고 함량의 철분 및 칼슘 등 미네랄 성분이 풍부한 것으로 조사되었으며, 알러지성 피부염을 억제하는 성분인 사크란(Sacran, sulfated polysaccharide)이 함유되어 있어 약리학적 활용도가 높게 평가되고 있다[9]. 하지만 국내 자생 민물김에 대한 생리활성물질 성분분석 및 약리학적 분석은 수행된바 없어 모든 정보를 일본의 문헌에 의존하는 실정이다. 따라서 본 연구는 국내 자생 민물김 추출물에 대한 생리활성물질 확인, 유용물질 분석 및 약리학적 특징을 확인하여 고부가가치 천연자원 후보물질로서의 민물김을 제시하고자 하였다.

Materials and Methods

실험재료 및 시료준비

 본 실험에 사용된 바다김(재래김, 파래김)은 전라남도 신안의 상품을 사용하였으며, 민물김은 2012년 5월 강원도 삼척시 소한천에서 채취한 뒤 석엽표본을 제작하였고, 표본은 국립생물자원관에 소장하였다(voucher NIBRCL0000102704). 시료로 사용된 바다김과 민물김은 염분 등 불순물들을 제거하기 위해 수돗물로 깨끗이 세척하였고, 70% 에탄올을 이용하여 살균처리 및 증류수 세척 후 동결건조 하여 사용하였다. 추출물은 곱게 파쇄한 각 시료 100 g을 1 L의 80% 에탄올에 침지하여 실온에서 24시간 주기로 3일 동안 추출 후 확보하였다. 에탄올 추출물은 Whatman Grade No. 1 filter paper (Whatman International Ltd., Maidstone, UK)로 여과하였으며, 증발기(evaporator)를 이용하여 용매를 증발시킨 시료를 실험에 사용하였다. 에탄올 추출물로 얻은 민물김 시료는 n-hexane, ethyl acetate, chloroform, n-butanol (BuOH), water를 통해 연속적으로 분획하였으며, 각각의 분획물 역시 증발기를 이용하여 건조시킨 뒤 실험에 사용하였다.

Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

 모든 시료들은 에탄올에 녹인 뒤 CTC CombiPAL autosampler system이 부착된 analytical Agilent Technologies 5975C GC/MS 기구를 이용하여 분석하였다. 크로마토그래피 분리는 헬륨 캐리어 가스와 HP-5 컬럼(250 μm × 0.25 μm × 30 m, Agilent Technologies, USA)을 이용하여 수행하였다. 각 시료들은 10 μL씩 인젝터에 주입하였으며, 주입방식은 split 방식으로 비율은 5:1로 설정하였고, 컬럼의 흐름은 각각 5 mL/min, 1 mL/min로 설정하였다. 인젝터의 온도는 250℃, 트랜스퍼라인 (transfer line)은 250℃로 설정하였으며, GC 오븐은 50℃ 에서 3분 동안 유지 후 50℃에서 280℃까지 10℃/min씩 증가시켰으며, 각 온도에서 3분 동안 유지시켜 분리가 일어나도록 하였다. 이온소스(Ion source) 온도는 250℃ 로 설정하였으며, 이온화 에너지는 −70 V로 고정하여 진행하였다. 분석 결과는 1059 V하에서 4분 간격으로 35~250 m/z의 범위에서 수집되었다. 분리된 성분들은 머무름 시간(retention time)과 질량범위(mass spectra)를 바탕으로 Wiley7N library data와 비교하여 분석하였다.

세포배양

 본 연구에 사용된 세포주는 murine macrophage cell line인 RAW264.7과 골근육세포주인 L6 세포(KCLB, Seoul, Korea)를 구입하여 사용하였다. 세포주는 10% fetal bovine serum을 포함한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) (Hyclone, UT, USA)을 사용하여 37℃, 5% CO2로 조정된 CO2 배양기에서 배양하였다. 세포가 90% 성장이 되었을 때 실험에 사용하였으며, 20 passage가 넘지 않도록 조절하였다. 배양된 세포는 0.25% trypsin-EDTA로 부유 시킨 후 혈구계산기로 세포 수를 산정하였다. 세포독성 시험은 배양된 세포를 96 well plate에 1.0 × 104 cells/well이 되도록 하였고 유전자발현 시험은 6 well plate에 1.5 × 106 cells/well이 되도록 분주하여 2시간 선 배양 후 본 실험에 사용하였다.

세포활성 및 세포독성

 세포생존율은 세포 내 미토콘드리아 전자전달계에 존재하는 탈수소 효소(dehydrogenase)가 Tetrazolium Salts를 분해하여 Formazan이라는 발색물질을 생성하는 원리를 활용한 Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japan)를 사용하였으며, 세포독성여부는 시료의 세포막 손상에 따라 배지로 유출된 lactate dehydrogenase (LDH)량을 측정하는 LDH release assay (CytoTox 96 Kit, Promega, WI, USA)를 사용하여 수행하였다. 즉, RAW264.7 세포 1.0 × 104 cells/well을 96-well plate에 seeding후 2시간 선 배양하여 안정화 시키고, 무혈청배지 100 μL로 배지 교체와 함께 시료를 농도(0.1, 1, 10, 100 μg/mL)별로 처리 후 24시간 배양을 하였다. 반응 종료 후 세포생존율 분석을 위해 각 well에 10 μL CCK 용액을 각 well에 넣고 2시간 동안 37℃ 배양기에서 배양한 후 450 nm의 파장을 사용하여 ELISA reader (SpectraMax plus384, Molecular Devices, CA, USA)로 흡광도를 측정하여 세포 생존 정도를 비교하였다. 세포독성은 동일한 배양 과정 후 각 well로부터 50 μL의 배지를 취하여 동량의 LDH 반응액을 넣고 암 조건에서 30분간 반응시켰으며, 반응 종료 후 stop solution 동량을 첨가한 뒤, ELISA reader를 이용하여 490 nm에서 측정된 흡광도 상대수치를 대조군 대비 cell viability (%)으로 표시하였다.

Nitric oxide 측정

 Nitric oxide (NO) 측정은 RAW264.7 세포에 각 에탄올 추출물 시료(10, 25 μg/mL) 및 민물김 용매분획물(10, 25 μg/mL) 처리 후 24시간 동안 배양 한 뒤 배지에 존재하는 nitrite의 수준을 측정하였다. 즉, 96 well plate에 1.0 × 104개의 RAW264.7 세포를 분주하여 confluence가 80%일 때, PBS로 2번 세척한 후 무혈청 배지를 첨가하고 24시간 반응을 시켰다. 반응 종료 후 각 군에서 취한 배양액에 동량의 Griess reagent (Sigma-Aldrich, MO, USA)를 첨가하여 10분간 반응시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였으며, nitrite의 양은 표준곡선으로부터 μM로 제시하였다.

DPPH 라디칼 소거능

 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)은 화학적으로 안정화된 수용성 free radical로서 517 nm에서 특징적인 광흡수를 나타내는 보라색 화합물이다. 이 radical은 알코올 등의 유기용매에서 매우 안정하며, 항산화활성이 있는 물질과 만나면 전자를 내어주면서 라디칼(DPPH)이 소멸되어 최초 용액의 보라색에서 노란색으로 색깔이 변화하여 산화 활성을 육안으로도 쉽게 관찰할 수 있는 대표적인 항산화 활성실험법이다. 라디칼은 DPPH 0.3 mM을 함유한 methanol 용액을 제조하여 100 μg/mL 시험물질을 혼합한 후 실온에서 10분간 반응 후 517 nm에서 흡광도를 측정한 뒤 실험물질 간 라디칼 소거능을 비교 분석하였다.

금속이온촉매 산화억제 (BSA 분해)

 Bovine serum albumin (BSA, Sigma-Aldrich) 분해는 reactive oxygen species (ROS)에 의한 손상으로부터 단백질이나 효소를 보호하는 항산화 물질의 효과를 금속이온촉매반응을 이용해 확인하는 방법이다[10, 11]. Target protein으로서 BSA를 0.5 μg/mL 농도가 되도록하고, 1차 반응으로서 Cu2+ (100 μM)와 H2O2 (2.5 mM)를 첨가하여 hydroxyl radical을 생성하고 BSA와 각 농도별 실험물질(0.1, 1, 10, 100 μg/mL)를 함께 혼합 후 2차 반응을 수행하였다. 반응 종료된 각 그룹은 10% sodium dedoxyl sulfate (SDS)- polyacrylamide gel에 전기 영동하여 추출물 시료에 의한 BSA 단백질 degradation 저해 수준을 확인하였다. 양성대조군으로서 항산화 효과가 우수한 ascorbic acid (50 μM)를 사용하였다.

Glucose uptake 측정

 Glucose uptake 실험은 세포 내로 유입되는 glucose 탐색에 민감한 probe로서 fluorescent 2-deoxyglucose analog인 2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diaxol-4-yl) amino]-2-deoxyglucose (2-NBDG) (Molecular Probes, USA)를 이용하였으며, 형광현미경(exitation/emission=448/540 nm)하에서 관찰하였다. 골근육세포주인 L6 세포의 농도를 1.5 × 104 cells/mL로 계수하여 chamber slide (1.8 cm2/well, Nunc, USA)에 분주한 후 각 시료 단독(50 μg/mL) 또는 인슐린(0.4 mM)을 처리하였고, glucose-free media에서 24시간 배양하였다. 반응종료 후 10 μM 2-NBDG로 30분간 염색 후 1X PBS로 2회 세척하고, 4% paraformaldehyde로 고정하여 형광현미경으로 관찰하였다[12].

통계처리

 결과분석은 GraphPad Prizm 5.01 software를 이용하여 통계 처리하였다. 결과는 각 군별 mean ± S.D.로 나타내었고 각 실험군간 비교는 one way ANOVA로 분석한 후 Duncan’s multiple range tests로 P<0.05 수준에서 검증하였다.

Results

Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) 분석

 각 시료 에탄올 추출물의 GC-MS 분석결과 바다김인 재래김(cultivated Porphyra)과 파래김(natural Porphyra)의 retention times내 성분은 대동 소이한 것으로 분석되었으며, 두 시료 모두에서 주 활성성분으로 사료되는 사크란이 매우 높은 면적(%) 값을 나타내었다(Table 1). 특히 파래김의 경우 전체 성분 중 83.9%의 매우 높은 함량으로 존재함을 확인할 수 있었으나, 민물김의 경우 GC-MS 분석에서 확인되지 않아 매우 소량의 사크란이 존재하거나 존재하지 않을 가능성도 예측되었다. 흥미로운 결과로서 바다김과 비교 시 민물김에 매우 다양한 성분이 존재하는 것으로 분석되었으며 retention time 29.402분에서 irritable bowel syndrome (과민성대장증후군) 치료제로 사용되는 alverine이 0.3% 존재함이 확인되었다 (Fig. 1). 또한, 민물김 에탄올 추출물에는 바다김에서 확인되지 않은 유용한 활성성분인 mannose (1.0%), loliolide (0.5%), sorbitol (2.8%), glucitol (10.0%) 및 mannitol (65.1%)등이 함유되어있어 민물김의 약리학적 활용성이 높게 평가되었다. 민물김 에탄올 추출물로부터 용매 분획(ethyl acetate, hexane, chloroform, butanol, water)을 하여 GC-MS 분석을 수행한 결과 에탄올 추출물과 마찬가지로 사크란의 존재는 확인하지 못했으나 chloroform, butanol 및 water 분획에서 alverine이 존재하여 민물김의 활성성분 중 하나인 것을 시사하였다.

Table 1. Comparison of the GC-MS library between the ethanol extracts1

Fig. 1. Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) chromatogram of the PJE. Peaks were analyzed based on the GC-MS library listed in Table 1.

세포독성 (항암효과)

 항암효과 분석은 다양한 방법으로 확인할 수 있으나, 본 연구에서는 RAW264.7 세포주에 대한 세포생존율(CCK) 및 세포독성(LDH) 여부를 확인하여 항암활성을 확인하였다(Fig. 2). 결과에서와 같이 ethanol 추출물의 경우 세 시료 모두에서 100 μg/mL 처리 시 세포독성이 확인되지 않아 항암효과는 저조한 것으로 판단된다. 반면, Fig. 2C에 나타난 바와 같이 CCK 실험에서 민물김의 용매분획 중 water 분획을 제외한 모든 시료에서 100 μg/mL 처리 시 양성대조군인 H2O2와 유사한 수준의 세포독성을 나타냈다. 이와 같은 결과는 ethyl acetate 및 hexane 분획물 처리 시 CCK 결과와 유사한 패턴의 LDH 분비결과를 나타냈으나 butanol 분획시료 처리 시 CCK 실험에서 나타난 생존율 감소에 비해 LDH 분비가 정상수준에서 관찰되어 세포 독성이 아닌 세포증식억제 상태가 유지된 것으로 판단되었다 (Figs. 2C and 2D). 따라서 민물김 용매 분획물 100 μg/mL 이상에서 항암활성을 나타낼 것으로 생각된다.

Fig. 2. Cell viability (CCK) and cytotoxicity (LDH) assay in RAW264.7 cells. Cells were seeded in 96-well microplates and cultured with varying concentrations (0.1 to 100 μg/mL) of PJE or PJE fractions for 24 h. Concentration-dependent cell viability or cytotoxicity was compared with non-treated control cells (Ctrl). H2O2 (1 mM) was used as the positive control. Results are expressed as mean ± S.D. from three separate experiments. NPE; natural Porphyra extract, CPE; cultivated Porphyra extract, PJE; Prasiola japonica extract, CHCl3; chloroform fraction, EA; ethylacetate fraction, Hex; hexane fraction.

Nitic oxide 생성억제 (항염증 효과)

 Nitric oxide (NO)는 숙주방어, 세포 내 신호전달에 직간접적으로 영향을 미치는 포유류 세포의 주요 분비물질로서 NO 합성효소(NO synthase)에 의해 매개되는 L-arginine의 산화에 의해 만들어지는 생성물이다. 특히 NO는 면역시스템의 활성과 관련하여 대식세포에 의해 생성의 증가가 나타나는 특징을 가지므로 본 연구에서는 대식세포 자극인자인 lipopolysaccharide (LPS)를 처치하여 염증물질인 NO 생성을 유도하고 민물김 용매분획물에 의한 NO 생성 억제를 관찰하여 항염효과를 확인하고자 하였다(Fig. 3). LPS에 의해 증가되는 NO 생성은 water 분획물을 제외한 모든 분획물에 의해 효과적으로 억제되는 것으로 나타났으며, ethyl acetate와 hexane 분획물의 경우 10 μg/mL의 저농도에서도 유의한 효과를 나타냈다. 이와 같은 결과는 양성대조군인 NO synthase inhibitor, L-NMMA (L-NG-monomethyl arginine), 보다 우수한 NO 억제능을 보여 효과적인 항염증 소재로의 개발가능성도 제시하였다.

Fig. 3. Effect of PJE solvent fractions on LPS-Induced NO Production. RAW 264.7 cells were exposed to water, butanol, chloroform, ethyl acetate, hexane fraction, (10 and 25 μg/mL) for the indicated time. The NO production was assayed from the culture medium of cells stimulated with LPS (1 μg/mL) in the presence of each fraction for 24 h. The experiments were performed in triplicate and the results are expressed as the mean ± S.D. L-NMMA was used as a positive control. *, P<0.05, **, P<0.01, ***, P<0.001 vs. LPS-treated control group.

항산화 효과

 항산화효능검색은 DPPH 라디칼 소거능과 hydroxyl 라디칼의 단백질 분해억제능을 통해 확인하였다. 즉, DPPH는 화학적으로 안정화 된 수용성 자유기로서 517 nm에서 특징적인 광흡수를 나타내는 보라색 화합물이며, 항산화활성이 있는 물질과 만나면 전자를 내어주면서 라디칼(DPPH)이 소멸되어 보라색빛깔에서 노란색으로 색깔이 변하게 되어 산화 활성을 육안으로도 쉽게 관찰할 수 있는 장점이 있다. 또한, 인위적으로 생성된 hydroxyl 라디칼의 단백질 분해 억제 효능을 확인하여 효과적인 항산화 효능을 분석할 수 있다. 따라서 이 두 가지 방법을 통하여 각 시료의 ethanol 추출물 및 민물김 각 용매분획물에 의한 라디칼 소거능과 항산화 수준을 비교하고자 하였다. DPPH 분석결과 민물김의 ethanol 추출물에 의한 라디칼 소거능은 고농도(100 μg/mL)에서 나타났으며, 민물김 용매분회 중 water 및 butanol 분획물에서 상대적으로 효능이 있을 것으로 판단되었다(Fig. 4). 반면, hydroxyl radical 소거능은 민물김의 ethanol 추출물/민물김 용매분획물 모두에서 10 μg/mL이상일 때 우수한 효능을 나타내는 것으로 확인되었으며, 본 실험에서 사용된 대조물질은 ascorbic acid 50 μM을 사용하여 비교하였다(Fig. 5).

Fig. 4. Radical scavenging activity at different concentrations. DPPH free radical scavenging activity in PJE and five different PJE fractions (water, butanol, chloroform and hexane) at different concentrations (0.1~100 μg/mL) was determined for a fixed time (5 min).

Fig. 5. PAGE profiles of the BSA protein with Cu2+/H2O2. Protein degradation of (A) ethanol extracts from CPE, NPE, PJE and (B) five PJE fractions were compared as described in Materials and Methods. The gels show the protein obtained without treatment, with Cu2+/H2O2, and at different concentrations of each sample (0.1~100 μg/mL). Ascorbic acid (50 μM) and DMSO were used as a positive and a vehicle control, respectively. The final steps include the incubation of all reactants, including BSA, for 2 h and electrophoresis in 10% SDS-PAGE.

Glucose uptake 촉진

 본 연구에서 사용한 L6 myoblast 세포는 horse serum 자극에 의해 functional myotube로 분화되며, 이는 인슐린 자극에 의해 glucose uptake를 측정할 수 있는 모델로 사용된다. 민물김 용매 분획물의 glucose uptake 기여 여부를 확인하기 위해 형광현미경 하에서 glucose의 uptake를 관찰할 수 있는 fluorescent deoxyglucose analog (2-NBDG)를 사용하여 L6 세포 내 2-NBDG 수준을 확인하였다(Fig. 6). L6 myoblast 세포주에 의한 glucose uptake 실험결과 민물김 ethanol 추출물을 제외한 민물김 용매분획물 전체에서 glucose uptake가 효과적으로 일어나고 있음이 관찰되어 민물김 용매분획물에 의한 혈 중 당조절이 가능 할 것으로 사료되었으며, chloroform 분획물 처리 시 매우 효과적인 결과가 관찰되어 당 조절 유효물질 함유에 대한 고찰이 요구된다.

Fig. 6. Glucose uptake analysis in L6 myoblast cells. L6 cells (1.5 × 104 cells/mL) were seeded in 4-well chamber slides and incubated with PJE or PJE fractions (50 μg/mL) for 24 hr, followed by the treatment with 2-NBDG for 30 min as described in Materials and Methods. 0.4 mM insulin was treated and compared for the Glucose uptake enhancement. Magnification=200×.

Discussion

 유엔환경계획(UNEP)의 보고(92년)에 의하면 현재 지구상의 총 생물종은 약 3,000만종으로 추정되고 있으나, 인구증가와 야생동식물의 남획, 각종 산업개발 및 환경오염 등으로 인한 자연서식지의 파괴를 통한 동식물의 멸종 위험성을 인지하여 국제적으로 “생물다양성협약(1992)” 및 “나고야 의정서(2010)”를 제정하고 한 국가가 소유한 생물자원에 대하여 해당 국가에게 권리를 인정하고 있다. 우리나라도 1994년에 가입되어 전 세계적 생물자원확보 선점을 위해 치열한 경쟁일선에 있다. 이러한 관점에서 본 연구의 시료인 민물김은 강원도 근덕면 하맹방리의 소한천에서 지역주민에 의해 구전되어온 국내 천연자원으로서 국내 보고[3]외에 전 세계적으로 아직 공식적으로 보고된 바 없는 희소적 가치가 높은 천연소재이다. 따라서 본 연구를 통해 국내 희귀식물인 민물김에 대한 활성물질 분석 및 약리학적 효능효과와 더불어 기능성소재 개발의 가능성을 확인하고자 하였으며, 대조물질로서 바다김인 재래김(양식김), 파래김(자연산김)과의 비교연구를 수행하였다. 성분분석은 주정 추출물(ethanol extracts)을 1차 연구대상으로 하였으며, 민물김의 용매분획물(water, butanol, chloroform, ethyl acetate, hexane층)에 대한 2차 연구는 1차 연구와 동일한 조건에서 상대적 비교분석을 수행하였다. 효능효과분석에 앞서 수행한 생리활성물질 분석 결과 바다김인 재래김과 돌김의 성분은 대동소이하였으며, 스이젠지노리에서 분리동정된 활성물질 사크란 성분은 관찰되지 않았다. 오히려 재래김과 파래김에서 각각 28.7% 및 83.9%의 높은 함량이 존재함을 확인했으며 5종의 민물김 용매 분획물에서도 사크란이 관찰되지 않아 민물김 성분 중 극소량이 존재하거나 존재하지 않는 것으로 사료되었다. 이러한 활성 성분의 차이는 유전적 차이에서 기인했을 가능성이 높은 것으로 생각되며, 이는 우리나라 민물김과 일본 민물김이 서로 독립된 분류군임을 반증하는 것으로 우리나라 민물김이 가지는 희소가치가 더욱 높이 평가되는 결과로 사료된다. 한편 민물김에는 바다김에서 관찰되지 않았던 mannose, loliolide, sorbitol, glucitol, mannitol 및 alverine 등이 관찰되어 약리학적으로 유용한 소재로서의 개발이 가능함을 제시하였다. 특히 mannitol이 전체 성분 중 약 65.1%를 차지하고 있으며 약리학적으로 mannitol은 삼투성 이뇨제로 사용되며 특히 두개압을 낮추거나 cisplatin과 같은 신독성 물질의 제거를 촉진시키는 효능이 있다[13, 14]. 중국 등에서 해초류로부터 mannitol을 대량 생산하고 있어, 민물김으로부터 고함량의 mannitol 추출이 가능할 것으로 생각된다. 매우 흥미로운 결과로서 민물김 추출물에서 위장관계 경련완화제(진경제, 평활근 이완제)로 사용되고 있는 alverine이 존재함을 확인하였다[15]. Alverine은 과민성 대장증후군에도 사용되는 제제로서 민물김에서 천연물질 상태로 추출할 경우 위장관 계통의 천연물신약 또는 기능성신소재로의 개발이 가능할 것으로 사료된다. 민물김 성분 중 sorbitol은 보습제 등 화장품 소재, 구강청결제제 및 비자극성 배변보조제로의 활용이 가능할 것으로 사료되며, 바다김과는 다르게 항산화효과를 가지는 loliolide를 함유하고 있어 본 연구에서 나타나는 항산화효과의 주요 작용 성분으로 사료되었다[16, 17, 18]. 민물김은 ethanol 추출물보다 용매분획물질에서 보다 우수한 효과가 나타났는데, 이는 용매분획마다 특징이 유사한 성분 또는 단독물질이 모여 극적 효과가 나타난 것으로 사료되었다. 민물김의 항암성은 hexane 분획물에서, NO 생성 억제를 통한 항염증 효과는 chloroform/ethyl acetate/hexane 분획물에서 강하게 나타날 것으로 분석되었으며,라디칼소거능(항산화효과)은 hydroxyl radical에 대해 10 μg/mL의 비교적 저농도에서 특이적 소거능을 가지는 것으로 판단되었다. Glucose uptake 실험에서 민물김의 용매분획물 처리 시 양성대조군인 인슐린과 대등 또는 보다 효과적인 glucose uptake를 촉진하는 것으로 나타났으며, 특히 chloroform 분획물을 처리한 경우 매우 현격한 촉진현상이 관찰되었다. 이와 같은 결과로부터 민물김이 인슐린 저항성에 의한 당 흡수 저해를 조절하여 말초조직내 당 흡수율을 높여 줄 것으로 예측되었다. 이상의 결과로부터 국내자생 민물김은 바다김보다 다양한 생리활성물질을 함유하는 것으로 나타났으며, 이 들 중 다수의 성분이 특이적 약리활성(항암, 항염증, 항산화 및 항당뇨)을 가지는 것으로 예상되었다. 이에 보다 다양한 in vitro 및 in vivo 실험이 요구되나 민물김이 함유하고 있는 mannitol 및 alverine등의 소재들은 천연자원유래 삼투성 이뇨 및 과민성대장증후 완화 등의 효능을 가지는 신약/신소재로서 개발과 함께 항산화, 항염 등에 대한 기능성 소재로의 개발가능성도 높은 것으로 판단된다.

Acknowledgements

 본 논문은 지식경제부 지방기술혁신사업(RTI05-01-02) 지원으로 수행되었으며, 연구 재료 제공 등 기반지원을 해 주신 삼척시 관계자 분들께 감사 드립니다.

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